Изучение физико-химических свойств, химического состава и структуры возможно только при исследовании очищенного белкового препарата. Для выделения и фракционирования индивидуальных белков используются: высаливание, осаждение органическими растворителями, гельфильтрация, электрофорез, ионообменная хроматография, аффинная хроматография.

Высаливание белков основано на зависимости растворимости белка от свойств среды. В дистиллированной воде протеины растворяются хуже, чем в слабых растворах солей, так как низкие концентрации ионов поддерживают их гидратные оболочки. Но при высоких концентрациях соли молекулы белка теряют гидратные оболочки, агрегируют и образуется осадок. После удаления соли белки вновь переходят в раствор, сохраняя нативные свойства и конформацию.

Изменение растворимости при различных концентрациях соли и рН среды используется для выделения индивидуальных белков. Чаще всего для высаливания белков используют растворы сульфата аммония разной концентрации.

Осаждение белков из раствора без их денатурации осуществляют с помощью дегидрирующих агентов - органических растворителей (этанол, ацетон).

Гель-фильтрация основана на разделении белков по величине и форме молекулы. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных гранулами пористого геля (сефадекса, агарозы), в буферном растворе с определенным значением рН. Гранулы геля проницаемы для белков благодаря внутренним каналам (порам) с определенным средним диаметром, размер которого зависит от типа геля (сефадекс G-25, G-200 и т.д.). Смесь белков вносят в колонку и затем вымывают (элюируют) буферным раствором с определенным значением рН. Крупные молекулы белка не проникают в поры геля и перемещаются с высокой скоростью вместе с растворителем. Мелкие молекулы низкомолекулярной примеси (соли) или другого белка удерживаются гранулами геля и вымываются из колонки медленнее (рис. 1.29). На выходе колонки раствор (элюат) собирают в виде отдельных фракций.

Рис. 1.29. Разделение белков методом гель-фильтрации

Электрофорез основан на свойстве заряженных молекул белка перемещаться в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие при данном значении рН суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду, а положительный - к катоду. Электрофорез проводят на разных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. Скорость перемещения зависит от заряда, массы и формы молекул белка. После завершения электрофореза зоны белков на носителе окрашивают специальными красителями (рис. 1.30, А).

Разрешающая способность электрофореза в геле выше, чем на бумаге, так при электрофорезе белков сыворотки крови на бумаге выделяют 5 фракций (альбумины, α 1 -, α 2 -, β-, γ-глобулины), а в полиакриламидном геле - до 18 фракций (рис. 1.30, Б).

Рис. 1.30. Электрофореграмма белков сыворотки крови здорового человека

А - электрофореграмма белков сыворотки крови на бумаге;

Б - количество белков плазмы разных фракций.

I - γ-глобулины; II - β-глобулины; III - а 2 -глобулины;

IV - а 1 -глобулины; V - альбумины

Ионообменная хроматография основана на разделении белков, отличающихся суммарным зарядом. Раствор белка с определенным значением рН пропускают через хроматографическую колонку, заполненную твердым пористым сорбентом, при этом часть белков задерживается в результате электростатического взаимодействия. В качестве сорбента используют ионообменные вещества: анионообменники (содержащие катионные группы) для выделения кислых белков; катионообменники (содержащие анионные группы) для выделения основных белков.

При пропускании белка через колонку прочность его связывания с ионообменником зависит от величины заряда, противоположного заряду сорбента. Адсорбированные на ионообменном сорбенте белки элюируют буферными растворами с различной концентрацией соли и рН, получая разные фракции белков.

Аффинная хроматография основана на специфичности связывания белка с лигандом, присоединенным к твердому носителю. В качестве лиганда используются субстраты ферментов, простетические группы холопротеинов, антигены и т.д. При пропускании через колонку смеси белков к лиганду присоединяется только комплементарный протеин (рис. 1.31, А), все остальные выходят вместе с раствором. Адсорбированный белок элюируется раствором с другим значением рН (рис. 1.31, Б). Этот метод высокоспецифичен и позволяет получать белковые препараты высокой степени очистки.

Выделение и очистка белка обычно проходят в несколько стадий с использованием различных методов. Последовательность стадий подбирается эмпирическим путем и может различаться для разных протеинов. Высокая степень очистки белков очень важна как при использовании их в качестве лекарственных препаратов (гормон инсулин и т.д.), так и при диагностике различных заболеваний по изменению белкового состава тканей, крови, слюны и др.

Набор белков в клетках различных органов взрослого человека индивидуален и поддерживается относительно постоянным на протяжении жизни. Специализированные ткани могут содержать специфические белки, например гемоглобин в эритроцитах, актин и миозин в мышцах, родопсин в сетчатке глаза, разные типы коллагена в костной и соединительной тканях. Некоторые белки содержатся во многих тканях, но в разных количествах. Отдельные изменения состава

Рис. 1.31. Разделение белков методом аффинной хроматографии

А - связывание выделяемого белка со специфическим лигандом, присоединенным к нейтральному носителю; Б - получение раствора индивидуального белка

белков тканей и крови возможны и связаны прежде всего с режимом питания, составом пищи, физической активностью человека.

При заболеваниях белковый состав крови и клеток тканей может существенно изменяться, часто развивается недостаточность какого-либо белка либо снижение его активности - протеинопатия. Поэтому определение выраженных изменений белкового состава крови и тканей используется для диагностики различных заболеваний в клинических исследованиях.

Особенности строения и функционирования организма зависят от набора белков, синтезирующихся в нем. Изучение строения и свойств белков невозможно без их выделения из клетки и очистки от других белков и органических молекул. Стадии выделения и очистки индивидуальных белков:

1 Разрушение клеток изучаемой ткани и получение гомогената.

2 Разделение гомогената на фракции центрифугированием, получение ядерной, митохондриальной, цитозольной или иной фракции, содержащей искомый белок.

3 Избирательная тепловая денатурация - кратковременное нагревание раствора белков, при котором можно удалить часть денатурированных белковых примесей (в том случае, если белок относительно термостабилен).

4 Высаливание. Различные белки выпадают в осадок при разной концентрации соли в растворе. Постепенно повышая ее концентрацию, можно получить ряд отдельных фракций с преимущественным содержанием выделяемого белка в одной из них. Наиболее часто для фракционирования белков используют сульфат аммония. Белки с наименьшей растворимостью выпадают в осадок при небольшой концентрации солей.

5 Гель-фильтрация - метод молекулярного просеивания молекул через набухшие гранулы сефадекса (трехмерные полисахаридные цепи декстрана, имеющие поры). Скорость прохождения белков через колонку, заполненную сефадексом, будет зависеть от их молекулярной массы: чем меньше масса молекул, тем легче они проникают внутрь гранул и дольше там задерживаются, чем больше масса, тем быстрее они элюируются с колонки.

6 Ультрацентрифугирование - метод, заключающийся в том, что белки в центрифужной пробирке помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора скорость оседания белков пропорциональна их молекулярной массе: более тяжелые белки образуют фракции, расположенные ближе ко дну кюветы, более легкие - к поверхности.

7 Электрофорез - метод, в основе которого лежат различия в скорости движения белков в электрическом поле. Эта величина пропорциональна заряду белков. Электрофорез белков проводят на бумаге (где скорость движения белков пропорциональна только их заряду) или в полиакриламидном геле, имеющем определенную величину пор (скорость движения белков пропорциональна их заряду и молекулярной массе).

8 Ионообменная хроматография - метод фракционирования, основанный на связывании ионизированных групп белков с противоположно заряженными группами ионообменных нерастворимых полимеров. Прочность связывания белка со смолой пропорциональна заряду белка. Белки, адсорбированные на ионообменном полимере, можно смыть возрастающими концентрациями NaСl; чем меньше заряд белка, тем меньшая концентрация NaСl потребуется, чтобы смыть белок, прикрепленный к ионогенным группам смолы.

9 Аффинная хроматография - наиболее специфический метод выделения индивидуальных белков. К инертному полимеру ковалентно присоединяется лиганд какого-либо белка. При пропускании раствора белков через колонку с полимером за счет комплементарного связывания белка с лигандом на колонке адсорбируется только специфичный для данного лиганда белок.

10 Для удаления низкомолекулярных соединений из раствора выделяемого белка применяют диализ. Метод основан на неспособности белков проходить через полупроницаемую мембрану, легко пропускающую низкомолекулярные вещества, в частности соли. Применяется для очистки белков от низкомолекулярных примесей, например от солей после высаливания.

Задания

1 Определите суммарный заряд пентапептида при рН 7,0:

Глу-Арг-Лиз-Вал-Асп

Как изменится суммарный заряд этого пептида:

а) при рН<7,0;

б) при рН >7,0?

2 Определите ИЭТ пептидов (>, < или =7,0):

а) Про-Лиз-Тир-Глн-Три;

б) Ала-Сер-Глу-Асн-Мет.

3 Сравните направление движения в электрическом поле двух пептидов при рН 7,0 (к катоду или аноду):

а) Вал-Глу-Ала;

б) Лей-Асн-Арг.

4 Сравните растворимость двух пептидов при рН 7,0:

Сер-Цис-Глу-Тир-Асп;

Вал-Арг-Мет-Фен-Тир.

5 В ядерных белках-гистонах содержится большое количество аминокислотных остатков аргинина и лизина, а в белке крови альбумине – много остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот. Ответьте на вопросы:

а) в каких средах (>, < или =7,0) лежит ИЭТ этих белков?

б) с каким из двух белков может взаимодействовать Са 2+ ?

6 Подберите к пронумерованному методу разделения и очистки белков их соответствующие свойства, на которых основан данный метод:

А) Различия по величине заряда.

Б) Различия по молекулярной массе.

Г) Ни один.

1 Гель-фильтрация.

2 Электрофорез в полиакриламидном геле.

3 Аффинная хроматография.

4 Ионообменная хроматография.

А) Ультрацентрифугирование.

Б) Гель-фильтрация.

В) Электрофорез в полиакриламидном геле.

Г) Ионообменная хроматография.

Д) Аффинная хроматография.

1 Используется для отделения белка от соли.

2 Метод основан на присоединении белка к иммобилизованному лиганду.

3 В основе метода лежит использование различий в молекулярной массе и заряде белков.

8 Выберите методы, с помощью которых можно разделить смесь белков на индивидуальные белки; укажите физико-химические свойства белков, лежащие в основе каждого метода.

9 Как суммарный заряд белка влияет на его растворимость:

а) определите суммарный заряд пептида при рН 7,0

Ала-Глу-Тре-Про-Асп-Лиз-Цис;

б) как изменится заряд этого пептида при рН >7,0, рН<7,0, рН<<7,0?

в) что такое изоэлектрическая точка (ИЭТ) белка и в какой среде лежит ИЭТ данного пептида?

г) при каком значении рН будет наблюдаться наименьшая растворимость данного пептида?

10 Почему кислое молоко в отличие от свежего при кипячении сворачивается (т.е. белок молока казеин выпадает в осадок)? В свежем молоке молекулы казеина имеют отрицательный заряд.

11 Решите задачу.Смесь, содержащую белки А, В и С с молекулярной массой соответственно 160 000, 80 000 и 60 000 Д, анализировали методом гель-фильтрации. Гранулы набухшего геля проницаемы для белков с мол. массой менее 70 000 Д. Укажите возможные варианты порядка выхода белков А, В и С из колонки.

12 Сравните использование метода диализа и гель-фильтрации:

1 Метод используется для очистки белков от низкомолекулярных соединений.

2 Метод используется для фракционирования высокомолекулярных веществ по различию молекулярной массы.

3 Метод используется для разделения белков по суммарному заряду.

4 Метод используется для определения молекулярной массы.

А) Характерно для диализа.

Б) Характерно для гель-фильтрации.

В) Характерно для обоих методов.

Г) Нехарактерно ни для одного из них.

5.3 Контрольные вопросы

1 От чего зависит растворимость белков?

2 Опишите этапы выделения и очистки белков. Что такое лиофилизация?

3 Молекулярная масса белков и методы ее определения.

4 Амфотерные свойства белков. Изоэлектрическая точка.

Список используемой литературы

1 Биохимия // под ред. Е.С.Северина, А.Я.Николаева. – М: ГЭОТАЗ-МЕД. 2001. – 449с.

2 Пластинина З.А., Жамсаранова С.Д. Методические указания для самостоятельной подготовки к лабораторным занятиям по биологической химии. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2003. - 109 с.

3 Филиппович Ю.Б. Биохимия белка и нуклеиновых кислот. - М.: Просвещение. 1978. - 203 с.

4 Анисимов А.А. и др. Основы биохимии. - М.: Высш. шк., 1985. - 398с.

5 Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. - М.: Просвещение, 1982. - 157 с.

6 Остроумов С.А. Введение в биохимическую экологию. - М.: Мир, 1986. -

7 Уильямс Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. - М.:Мир, 1978. - 268 с.

На каких физико-химических особенностях белков могут быть основаны способы их разделения? Во-первых, это размер молекулы, ее геометрия. На использовании этой особенности базируются методы гель-хроматографии и ультрафильтрации, отчасти электрофорез в гелях.

Во-вторых, характерное для данного белка распределение заряженных групп на его поверхности. Соотношение катионных и анионных групп в белке меняется в зависимости от рН, изоэлектрические точки белков -- pI (значения рН, при котором положительные и отрицательные заряды белка полностью компенсированы и суммарный заряд равен нулю) существенно различаются у разных белков. Известны белки, являющиеся в физиологических условиях катионными, анионными или молекулами без заметного преобладания того или иного заряда. На различии заряда белков при разных рН основано их разделение методами электрофореза, изоэлектрического фокусирования, изоэлектрической и ионообменной хроматографии. Существенно, однако, не только соотношение заряженных групп, определяющее значение pI. Белки со сходными изоэлектрическими точками могут различаться распределением заряженных функциональных групп по поверхности глобулы. Последние размещаются более или менее равномерно либо; наоборот, образуют локальные сгущения, гроздья одинаково заряженных групп, что сказывается при ионнообменной хроматографии белка.

В-третьих, белки различаются числом и характером гидрофобных участков поверхности, что используют при гидрофобной хроматографии

Заметим, что ни один из рассмотренных выше признаков не может сам по себе обеспечить выделение индивидуального белка из сложной смеси -- они недостаточно характеристичны, не гарантируют избирательности очистки. Значительно более перспективно в этом отношении

использование для выделения функциональных свойств белка. Действительно, среди множества белков в исходном материале найдется немало таких, которые имеют сходную молекулярную массу или близкие изоэлектрические точки, однако число, например, фосфатаз или амилаз будет заведомо небольшим. Очевидно, что метод выделения, основанный на использовании способности этих ферментов взаимодействовать со своим специфическим субстратом, несравненно избирательнее, чем любой прием, базирующийся на разнице физико-химических свойств.

Схемы выделения белков, использующие только один какой-либо принцип, редки, обычно различные подходы к фракционированию сочетаются и дополняют друг друга.

Разделение белков по молекулярной массе. Гель-хроматография (гель-фильтрация)

В этом методе используют гранулированные гели поперечно-сшитых гидрофильных материалов, например декстрана (сефадекс, сефароза и их аналоги), полиакриламида (биогели и их аналоги), поливинилового спирта (тойоперл). Гранулы образованы трехмерной сеткой полимера, которая непроницаема для крупных молекул, частично проницаема для молекул промежуточного размера и хорошо проницаема для небольших молекул, солей и воды. В зависимости от среднего размера ячейки полимерного геля и геометрии молекулы последней доступна большая или меньшая часть общего объема гранул геля.

При движении раствора, содержащего белки и другие молекулы, по колонке, которая заполнена набухшими гранулами геля, компоненты смеси, проникшие в гель, задерживаются в нем. Таким образом, они отстают от более крупных молекул, которые не могут войти внутрь гранул и находятся только в омывающем их растворе. Не будучи включенными в гель, крупные молекулы появляются в элюате, как только через колонку пройдет "свободный" объем раствора, равный объему раствора, заключенному между гранулами геля. Последний определяется плотностью упаковки и геометрией гранул. Для сферических частиц, в виде которых обычно и выпускаются материалы для гель-хроматографии, свободный объем составляет 30--35% общего объема колонки.

Если размеры молекул белка таковы, что они могут проникать в поры, составляющие некоторую часть объема гранул, то будет наблюдаться задержка элюции и белок появится в объеме V e , связанном с коэффициентом доступности (долей объема гранул, доступной данному виду молекул) соотношением:

где V, -- полный объем колонки, за вычетом той его части, которая приходится на сам гель образующий полимер.

Каждому белку в зависимости от размеров его молекулы соответствует свое значение, на чем и основало разделение при гель-хроматографии. Понятно, что если объем элюции близок к свободному объему, то стремится к нулю и разделения белков, молекулы которых практически не входят в поры геля, не произойдет. Точно так же молекулы небольших размеров, для которых проницаем весь объем геля (V e близок к и стремится к единице), в геле с данными характеристиками не разделятся. Наилучшее разрешение получается, если находится в пределах 0,4 -- 0,6. Разумеется, пределы разделения можно расширить, используя для высокомолекулярных белков крупнопористые, а для небольших -- мелкопористые гели.

Строго говоря, при гель-хроматографии разделение белков определяется не молекулярной массой, а геометрическими размерами молекулы. Соответственно, молекулы вытянутой формы за счет "кувыркания" в растворе труднее проникают в гели, чем сферические молекулы такой же молекулярной массы. Этим объясняется ранняя элюция денатурированных белков, которые ведут себя как неупорядоченный рыхлый клубок, а не как компактная глобула.

Простая зависимость между объемом элюции и молекулярной массой белка (справедливая, конечно, только для компактных сферических молекул) и легкость эксперимента сделали гель-хроматографию излюбленным методом определения молекулярной массы белков. Для этой цели колонку, заполненную соответствующим гелем, калибруют набором белков с известными молекулярными массами, после чего определяют объем элюции изучаемого белка и вычисляют его молекулярную массу интерполяцией. Точность метода не очень велика, но вполне достаточна для большинства практически встречающихся задач.

При использовании данного метода необходимо учитывать ограничения, возникающие из-за того, что гель, образующий материал не вполне инертен, как это предполагает теория метода, и может взаимодействовать с разделяемыми веществами, что искажает зависимость объема элюции от размера молекулы. Это особенно сказывается при разделении малых количеств белка, так как сорбционная емкость матрицы геля невелика и в крупномасштабных опытах ее взаимодействие с белком мало отражается на процессе.

Связывание белков гельобразующими материалами может быть вызвано ионообменными взаимодействиями, в частности содержанием отрицательно заряженных групп в полисахаридных матрицах (сефароза, сефадекс), а также в полиакриламидных материалах. В последних карбоксильные группы возникают при спонтанном гидролизе амидов, в полисахаридах же они могут образовываться в результате окисления. Задержка при гель-хроматографии, вызванная ионообменными взаимодействиями с матрицей, особенно характерна для катионных белков, например лизоцима и некоторых субтилизинов. Нередко она весьма значительна и может даже препятствовать отделению солей от белка. В аналитических опытах такое удерживание удается подавить значительным повышением ионной силы раствора.

Еще одна причина аномального удерживания веществ при гель-хроматографии, особенно заметная при выделении небольших молекул, например пептидов. -- гидрофобное связывание с матрицей геля.

Гидрофобные элементы включаются в гидрофильные полисахаридные матрицы при обработке их сшивающими агентами, в частности эпи-хлоргидрином, при синтезе сефадекса. Пептиды, содержащие гидрофобные, в особенности ароматические, остатки (фенилалаиина, триптофана) иногда удерживаются матрицей столь значительно, что появляются в элюате позже неорганических солей.

Разрешающая способность метода не очень велика, в то же время простота проведения и мягкость условий эксперимента являются его бесспорными преимуществами. Применимость метода на первых этапах очистки ограничивается тем, что для удовлетворительного фракционирования белков объем наносимого раствора не должен превышать

3-5% общего объема колонки. Ввиду этого к гель-хроматографии обычно прибегают в середине или на завершающих этапах выделения белка. Разумеется, при отделении низкомолекулярных примесей, в частности при обессоливании, объем образца может быть значительно большим, поскольку не требуется высокого разрешения. В таком упрощенном варианте гель-фильтрацию используют особенно часто.

Несмотря на указанные ограничения, гель-хроматография -- удобный способ фракционирования белков. Его применяют и для отделения от белков низкомолекулярных примесей, в том числе солей.

В последнее время наряду с гельобразующими материалами для разделения белков по размерам начали применять макропористые неорганические носители -- макропористые стекло и силикагель. Обычно поверхность этих материалов покрывают гидрофильными органическими веществами, чтобы исключить необратимую сорбцию белков. Жесткость этих материалов позволяет разделять белки по размеру молекул при повышенных давлениях, что ускоряет процесс и снижает помехи со стороны диффузии.

Состав и количество фракций белков в биологических жидкостях зависит от применяемого метода фракционирования:

1. Осаждение

• нейтральными солями (высаливание) - способность белков плазмы выпадать в осадок при воздействии на них растворов солей различных концентраций,
• этиловым спиртом при низкой температуре;

2. Электрофоретическое фракционирование - различают несколько типов электрофореза в зависимости от поддерживающей среды. В качестве поддерживающих сред используют бумагу, ацетатцеллюлозную пленку, агаровый, полиакриламидный, крахмальный гели. При проведении электрофореза необходимо учитывать факторы, влияющие на подвижность разделяемых веществ:

• заряд (обычно зависит от pH), размеры и форма молекул веществ;
• электрическое поле : скорость миграции ионов прямо пропорциональна силе тока, обусловленной переносом ионов буфера и образца, напряжению и обратно пропорциональна сопротивлению (зависит от типа и размеров носителя и ионной силы буфера);
• тип буфера : состав, концентрация, pH, ионная сила. Ионная сила равна сумме n составляющих: с n z n 2 / 2, где с n - молярная концентрация n-ого иона, z - заряд этого иона;
• носитель : учитывается его гидрофильность, адсорбция веществ на молекулах носителя, электроосмос, диффузия.

3. Иммунологические методы - основаны на иммунных свойствах белковых фракций: иммуноэлектрофорез, электроиммунодиффузия, радиальная иммунодиффузия, радиоиммунный анализ;

4. Седиментационный анализ - основан на различной зависимости скорости оседания белков от массы и величины их молекулы;

5. Ионообменная, адсорбционная, распределительная, аффинная хроматография , гель-фильтрация .

Наиболее распространенным методом фракционирования является электрофорез , основанный на разной скорости движения белков в электрическом поле, в зависимости от величины заряда и молекулярной массы. Количество выделяемых фракций определяется условиями проведения электрофореза и качеством поддерживающей среды. Так, например, при электрофорезе на бумаге и пленках ацетата целлюлозы выделяют 5 фракций (альбумины, α 1 –, α 2 –, β– и γ–глобулины), в то время как в полиакриламидном геле - до 20 и более фракций. При использовании более совершенных методов (радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и других) в составе глобулиновых фракций выявляются многочисленные индивидуальные белки.

За основу классификации белков по фракциям принято разделение белков на бумаге. На протеинограмму оказывают влияние только те белки, концентрация которых достаточно высока.

В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространены методы электрофореза на бумаге и на ацетатцеллюлозных пленках. В качестве унифицированного утвержден метод электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках.

Определение белковых фракций сыворотки крови экспресс-методом

Принцип

Фосфатные буферы разной молярной силы осаждают соответствующие фракции белка, при этом более концентрированные буферы осаждают более мелкодисперсные фракции белка. По степени мутности судят о концентрации фракций белка.

Метод электрофоретического разделения белков на бумаге и ацетатцеллюлозных пленках

Принцип

Коллоидные частицы белка перемещаются в электрическом поле постоянного тока: в щелочной среде к аноду, в кислой - к катоду. В щелочной среде наиболее быстро перемещаются альбумины, α 1 -, α 2 - и β-глобулины.

Более подробное описание метода электрофореза можно прочитать .

Нормальные величины

Сыворотка крови
преальбумин	0,6-1,4%	0,18-0,38 г/л
альбумин	50-70%	30-50 г/л
α 1 -глобулины	3-6%	1-3 г/л
α 2 -глобулины	9-15%	6-10 г/л
β-глобулины	8-18%	7-11 г/л
γ-глобулины	15-25%	8-16 г/л
Cоотношение альбумин / глобулины 1,5-2,3
Спинно-мозговая жидкость
преальбумин	2-7%
альбумин	56-76%
α 1 -глобулины	2-7%
α 2 -глобулины	4-12%
β-глобулины	8-18%
γ-глобулины	3-12%
Моча
альбумин	20%
α 1 -глобулины	12%
α 2 -глобулины	17%
β-глобулины	43%
γ-глобулины	8%

Клинико-диагностическое значение

Диагностическое значение измерения преальбуминв и альбумина рассмотрено

Сыворотка

Глобулины

На практике диагностически значимо только повышение уровня белковых фракций.

Повышение α 1 - и α 2 -глобулиновой фракции связано с острыми и подострыми воспалительными процессами и некоторыми злокачественными опухолями, травмами, т.к. сюда входит большинство белков острой фазы (С-реактивный белок, α 2 -макроглобулин, α 1 -гликопротеид, α 1 -антитрипсин, церулоплазмин, гаптоглобин).

Большая часть белков β-глобулиновой фракции является β‑липопротеинами, поэтому повышение этой фракции чаще всего связано с гиперлипопротеинемиями. Кроме того, влияние на динамику этой фракции оказывают трансферрин, гемопексин, компоненты системы комплемента.

Фракция γ‑глобулинов увеличивается при патологических состояниях, связанных с хроническими воспалительными процессами, т.к. содержит иммуноглобулины G, A и M.

Реферат на тему:

Разделение белков по размерам с использованием DDC-Na

Разделение белков по размерам с использованием DDC-Na

Электрофорез белков в простой системе удобно использовать для их разделения, но не характеристики. Электрофоретическая подвижность каждого белка в простой системе зависит одновременно и от массы белка, и от его суммарного электрического заряда, и от конфигурации, и от жесткости упаковки белковой глобулы. Вклад каждого из этих факторов неизвестен и может существенно изменяться в зависимости от условий электрофореза. Для установления строгой корреляции между каким-либо одним из перечисленных параметров и электрофоретической подвижностью белка надо исключить влияние всех остальных.

Электрофорез в ПААГ с использованием DDC-Na позволяет разделять белки, различающиеся между собой только по молекулярной массе. Для этого смесь белков в исходном препарате обрабатывают не менее, чем трехкратным избытком DDC-Na (по весу). За счет гидрофобных взаимодействий детергент одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг DDC-Na на 1 мг белка.

Огромный избыток полностью диссоциированных остатков сульфокислоты, привносимый детергентом, в большинстве случаев делает несущественной роль собственного заряда белка. Благодаря электростатическому отталкиванию тесно расположенных отрицательно заряженных остатков серной кислоты, белковая цепь распрямляется и приобретает форму жесткой палочки с поперечником -1,6 m и длиной, зависящей только от числа звеньев этой цепи, а следовательно - от молекулярной массы белка.

Одновременно с обработкой DDC-Na необходимо обеспечить возможность полного развертывания белковой цепи, а для этого - разорвать все ковалентные S-S связи внутри молекулы белка. С этой целью белок перед электрофорезом обрабатывают еще и высокой концентрацией (1%) (3-меркаптоэтанола при повышенной температуре.

Электрофретическая подвижность, т. е. скорость миграции при напряженности поля 1 В/см, жесткого комплекса белок DDC-Na оказывается связанной с молекулярной массой белка (М) простым соотношением A-BIgM, где А и В - коэффициенты, зависящие от пористости геля, температуры и других условий эксперимента. Величину и" удобнее представлять в относительных единицах, выражающих отношение путей миграции белка и «лидирующего красителя» - бромфенолового синего. Обозначим это отношение Rf. Такая замена отразится только на значении коэффициентов А и В, о которых нам известно только то, что они в данных условиях опыта одинаковы для всех белков. Измененные величины коэффициентов тоже будут постоянными величинами в данном опыте. Поэтому вместо их определения пользуются методом сравнения с известными по своей массе «маркерами». Одновременно с электрофорезом изучаемой смеси белков, отдельным треком на той же пластинке, т.е. в тождественных условиях эксперимента, разделяют смесь известных маркеров. С их помощью по точкам строят зависимость lgM=f(Rf), которая, естественно, оказывается прямолинейной. Опираясь на эту зависимость, можно графически, по измеренным величинам Rf определить значения lg М, а следовательно и М для исследуемого белкА. Разумеется, вся предварительная обработка детергентом и Р-меркаптоэтанолом должна быть проведена строго одинаково для этого белка и всех маркеров.

Выбор буфера в этом варианте не играет роли, так как заряд белка определяется его комплексом с DDC-Na. Обычно используют нейтральный буфер, добавляя в него 0,1% DDC-Na, чтобы поддержать комплекс детергента с белками»

Для белков с молекулярной массой менее 12 тысяч дальтон определение М становится ненадежным. Для различных диапазонов масс белков рекомендуется использовать ПААГ различной пористости, согласно следующей таблице:

Диапазон М (тысяч дальтон) % ПААГ 12-43 15 16-68 10 36-94 7,5 57-212 5

Сам процесс электрофореза и окраски белков после его окончания производят как обычно, но DDC-Na от белка предпочтительно отмыть до окраски, вымачивая гель в 50% -ной ТХУ в течение ночи.

DDC-Na в комплексе с белком в некоторой мере препятствует окрашиванию (большой отрицательный заряд!).

Двумерный электрофорез в ПААГ

Полное разделение сложной смеси белков не всегда удается осуществить в ходе одного электрофоретического эксперимента. Всегда есть вероятность того, что в данной системе электрофореза различные белки мигрируют в одной зоне либо в силу близости их размеров, либо ввиду совпадения их электрофоретических подвижностей при выбранном значении рН, либо, наконец, в результате неблагоприятной для разделения комбинации этих параметров. Поэтому в сложных случаях фракционирования смеси белков имеет смысл использовать разделение в первом направлении как исходное для разделения во втором, перпендикулярном первому направлении при измененных условиях электрофореза.

Для этого трек первого направления (без осаждения и окраски белков в нем) вырезают и накладывают на стартовую зону пластинки второго направления (без карманов). Контакт между двумя гелями обеспечивают заливая место их соприкосновения расплавленным раствором агарозы в том же буфере. Электрофорез, естественно, ведут в направлении, перпендикулярном полоске. Каждая негомогенная полоса в ней может дать несколько пятен во втором направлении, если в новых условиях содержавшиеся в ней белки обретут различную электрофоретическую подвижность. В результате после осаждения и прокрашивания на пластинке появляется картина распределенных по всей поверхности пятен («фингерпринт»). Число пятен различных белков, которое удается зафиксировать на одной пластине может достигнуть нескольких сотен. На рис. 42 воспроизведена картина распределения пятен, полученных при двумерном электрофорезе белков из большой субъединицы одной из бактерий (в работе Mets, Bogorad Anal. Biochem. 57 200, 1974).

Извлечение белков из геля после электрофореза

Для целей аналитической идентификации белки из ПААГ (без осаждения и окраски) можно перенести на нитроцеллюлозный мембранный фильтр. Такие фильтры обладают способностью сорбировать основные белки. Перенос осуществляется путем вымывания белковых полос из геля током буфера в направлении, перпендикулярном поверхности пластинки. Фильтр накладывают непосредственно на влажный гель. Устройство для обеспечения тока буфера от геля к фильтру будет описано ниже в связи с электрофорезом ДНК.

В результате на фильтре получаются «реплики» белков, разделенных в геле. Для их идентификации можно использовать характерные реакции, иногда ферментативные или имунные (см. ниже), а также гибридизацию с мечеными радиоактивным фосфором ДНК или РНК, если эти белки in vivo связывались с ДНК или разделению подвергались рибосомальные белки, связывающиеся с РНК рибосом.

Главное, что с точки зрения электрофореза отличает нуклеиновые кислоты от белков - это значительный по величине суммарный отрицательный заряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты в связях между нуклеозидами. рН окружающей среды мало влияет на этот заряд. Поэтому электрофорез можно вести не в буфере, а в любом подходящем ионосодержащем растворе, например в слабом растворе щелочи. Во всех случаях в жидкую среду вносят ЭДТА до концентрации 1-2 mM. Это необходимо для блокирования действия нуклеаз и предупреждения осаждения (особенно РНК) двухвалентными металлами.

Таким образом, разделение фрагментов ДНК и РНК электрофорезом приходится вести только по размеру. Однако размеры эти могут варьировать в очень широких пределах: от десятков нукле-отидных звеньев до многих сотен тысяч, а если выражать через молекулярные массы, то от нескольких тысяч до сотен миллионов дальтон.

Естественно, что для фракционирования относительно коротких фрагментов используют электрофорез в ПААГ, а для разделения высокомолекулярных ДНК, более крупнопористый носитель - агарозу. С ней мы познакомимся чуть позже. А пока в порядке связи с предыдущими параграфами уместно сделать несколько замечаний об электрофорезе ДНК в ПААГ. В нижеследующей таблице представлены рекомендации по выбору пористости геля в зависимости от размеров относительно коротких фрагментов ДНК, охарактеризованных числом пар оснований (п.о.):

Диапазон п.о. (штук)

В последнем диапазоне этой таблицы находятся предельные размеры ДНК, доступные автоматическому секвенированию последовательности нуклеотидов. Этот революционный метод анализа ДНК будет рассмотрен в следующей главе.

Сейчас же, прежде, чем перейти к электрофорезу в агарозе, я хочу познакомить учащихся и читателей с новыми идеями фракционирования крупных фрагментов ДНК в ПААГ с оригинальным использованием импульсов электрического напряжения, подаваемых на гель. Эти импульсы подаются поочередно в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Идея здесь заключается вот в чем. Даже очень длинная и гибкая молекула ДНК может протиснуться через относительно малые поры геля, если она вытянута в направлении продвижения к «основному» аноду, скажем, расположенному внизу пластинки. Напряжение на этот анод подается не постоянно, а импульсами. Второй, «вспомогательный» анод создает напряженность электрического поля, перпендикулярную основному направлению движения ДНК к низу пластинки. Напряжение на него подается тоже достаточно мощными, но более короткими импульсами, чем на основной анод, чередуясь с ними.

Назначение «перпендикулярного» электрического поля состоит в том, чтобы поворачивать длинные молекулы больших ДНК так, чтобы в момент подачи «продольного» импульса они находились в положении, благоприятном для движения вдоль пластинки вниз, к основному аноду. Чем длиннее цепи ДНК, тем медленнее они будут менять свою ориентировку и потому медленнее подвигаться в нужном направлении. Авторы метода утверждают, что таким образом в ПААГ им удавалось разделять фрагменты ДНК длиной до пяти миллионов пар оснований.

Гели агарозы

Агароза - это особо чистая фракция природного, линейного полисахарида, агара, выделяемого из морских водорослей. Мы с ним уже встречались.

Молекулярная масса одиночных нитей агарозы лежит в пределах 10-100 тысяч дальтон. Агароза для электрофореза поставляется в виде лиофилизированного (высушенного в вакууме) порошка. Гелеобразование происходит при остывании даже очень разбавленного горячего раствора агарозы в буфере. При температуре 84-96° С (а у некоторых типов агарозы уже при 70°) нити полимера плавятся и образуют с окружающей водной средой однородную прозрачную жидкость. Она обладает ярко выраженным температурным гистерезисом - застывает при температуре порядка 40°С. Остывая до этой температуры, даже 0,4% -ные растворы агарозы образуют прочные гели. У легкоплавких типов агарозы температура затвердевания снижается до 30°. Такая особенность агарозы облегчает все манипуляции с ее растворами, не опасаясь их затвердевания. Более того, расплавленную на кипящей бане взвесь агарозы в воде охлаждают до 50-55° и только при этой температуре добавляют концентрат буфера и все другие добавки, а затем заливают в форму для электрофореза. Это удобно и не связано с возникновением тепловых деформаций.

Остывая, хаотически ориентированные нити затвердевшей агарозы благодаря множественным водородным связям между нитями собираются в жгуты. Эти жгуты свободно перекрещиваясь, создают в окружающей их жидкости очень крупнопористую и, вместе с тем, жесткую пространственную сетку.

Размер пор геля агарозы, естественно, связан с концентрацией ее исходного раствора. Можно привести некоторые рекомендации по выбору этой концентрации, почерпнутые из опыта электрофореза нуклеиновых кислот:

Для нуклеиновых кислот вирусов и крупных плазмид 0,4-0,5%.

Для рестриктов ДНК, содержащих 5-20 тысяч пар оснований 0,7-0,8%.

Для более коротких рестриктов ДНК и двунитевых РНК рео-вируса 1,5%.

Для рибосомальных РНК - 1,75%.

Для иРНК и рестриктов ДНК до 1000 п.о. - 2% .

Приготовление пластины для электрофореза в агарозе очень просто. Нужного размера стекло оклеивают со всех сторон по ребру сплошной липкой лентой так, чтобы ее верхний край на несколько миллиметров выступал над поверхностью стекла. Последнее кладут на строго горизонтальный столик. Прямо на стекло выливают рассчитанный объем еще жидкого раствора агарозы. Затем в него близ одного края стекла устанавливают гребенку, подобную той, которую ставят в форму ПААГ перед его полимеризацией. Только на этот раз гребенку погружают в агарозу перпендикулярно стеклу (зубцы ее, однако, не должны касаться стекла). После застывания агарозы гребенку вынимают, образуя таким образом «колодцы» для препаратов. Электрофорез ведут в горизонтальном положении (в треках), накладывая фитили, идущие от резервуаров с буферами. Рабочее значение напряженности поля 2-5 В/см.

ДНК, особенно двунитевые, а также и РНК хорошо окрашиваются желтым флюоресцентным красителем - бромистым эти-дием. Этот краситель несет положительный заряд, что позволяет ему взаимодействовать с фосфатными группами нуклеиновых кислот. Кроме того он способен интеркалировать (встраиваться) между оснований двунитевой ДНК, что приводит к резкому усилению его флюоресценции при освещении ультрафиолетовым светом. Окраску можно производить и после электрофореза вымачиванием геля в течение 0,5-1 часа в водном растворе красителя (1 мкг/мл) или же вводить его непосредственно в гель. В последнем случае можно следить за движением полос в геле. Стеклянную пластину в этом случае освещают УФ-лампой снизу. Чувствительность окраски высока. Можно наблюдать и фотографировать полосы, содержащие 0,01 мкгДНК.

В конце электрофореза ДНК можно зафиксировать в геле осаждением из раствора, вымачивая гель в 70% -ном этаноле.

Пипетки

Конечно, современные микропипетки совсем не похожи на те, которые употребляют в школьном химическом кабинете. Их устройство таково. Довольно объемистую, пластмассовую (снаружи) рукоятку пипетки удобно держать четырьмя пальцами руки, оставив большой палец свободным для нажатия кнопки, торчащей из верхнего конца рукоятки. Книзу из нее выходит длинный, слегка конический металлический стержень, на конец которого плотно надевается конический полый наконечник из специальной пластмассы.

В рукоятке спрятан механизм, главную часть которого составляют очень точно подогнанные друг к другу тонкий цилиндр и поршень, отжимаемый кверху пружиной. Нажатием кнопки поршень перемещается вниз. Опустив наконечник в жидкость и освободив предварительно нажатую кнопку набирают в наконечник объем в 1, 2, 3 и более микролитров - в соответствии с калибровкой пипетки. Вторичным нажатием кнопки жидкость из наконечника полностью выталкивается. Наконечники поставляются стерилизованными и используются однократно.

Есть пипетки с возможностью предварительной регулировки объема жидкости, например, от 2-х до 20-ти микролитров. Регулировку осуществляют поворотом головки винта, который устанавливает длину хода поршня. Выбранный объем указывает связанный с винтом градуированный барабанчик.

Влияние вторичной структуры ДНК

В электрофоретическом поведении однонитевых (денатурированная ДНК, РНК) и двунитевых молекул нуклеиновых кислот многое определяется их размерами. В случае коротких полинуклеотидных цепей их нативная двунитевая молекула имеет более жесткую структуру, чем таких же размеров однонитевая молекула. Она труднее изгибается, проходя через пространственную сетку геля. В силу этого относительно короткие двунитевые фрагменты ДНК будут отставать при электрофорезе в ПААГ от денатурированных ДНК такой же длины. Такая ситуация будет иметь место даже для ДНК бактериофага ФХ-174 с молекулярной массой в 3,5 миллиона дальтон. Однако для более крупных молекул ситуация может измениться на противоположную. Длинная двунитевая цепочка оказывается уже достаточно гибкой: она продвигается через поры геля как бы «извиваясь ужом». Между тем однонитевая цепь той же длины сворачивается в рыхлый «хаотический клубок» такого размера, что его продвижение в геле оказывается более затрудненным. Денатурированная ДНК в этом случае при электрофорезе отстает от нативной. Естественно, что граница обращения описанного эффекта зависит от размеров пор геля.

Вирусные и митохондриальные двунитевые ДНК, а также плазмиды бактерий имеют структуру замкнутого двунитевого кольца. Нативное состояние такого кольца - «сверхскрученное» (ему отвечает минимум внутренних напряжений). Кольцо в целом сворачивается в «жгут», что сильно увеличивает его компактность (форма I). Если же хотя бы в одной из двух скрученных нитей кольца появляется единичный разрыв сахаро-фосфатной цепи, то жгут разворачивается и под действием сил электростатистического отталкивания фосфатных групп кольцо расправляется. Компактность молекулы уменьшается, ее наружные размеры увеличиваются (форма II). Что касается линейной двухните-вой молекулы ДНК (форма III), то в зависимости от среднего размера пор геля она может мигрировать быстрее или медленнее, чем сверхскрученное кольцо одинаковой с ней массы. Для крупнопористого геля решающим фактором может оказаться компактность формы I; для более мелких пор на первый план выступает большая гибкость линейной молекулы ДНК (форма III).

Скорость миграции линейных двухнитевых молекул ДНК уменьшается с увеличением их массы, но лишь до определенного предела. При молекулярной массе более 5 миллионов в 1,6%-ном геле агарозы и при массе более 12 миллионов дальтон в 0,8% -ной агарозе молекулы мигрируют практически с одинаковой скоростью, независимо от их массы. В этих случаях решающую роль играет гибкость - способность очень длинных молекул, извиваясь, проходить через гель одинаково легко (или одинаково трудно) при любой длине.

Рибосомальные РНК могут иметь существенно более невыгодную для миграции в геле вторичную структуру, чем ДНК. Дело в том, что у крупных молекул РНК эта структура представлена многочисленными, торчащими во все стороны «шпильками». Это - места локального спаривания в жесткие двунитевые структуры отдельных, зачастую далеко отстоящих друг от друга по основной последовательности, комплементарных участков РНК. Такая молекула уже не может продвигаться через поры геля Собирая основной «сэндвич» (гель, фильтр и облегающие их листки фильтровальной бумаги) следует проверять, что между ними не остаются пузырьки воздуха.

Перенос ДНК на нитроцеллюлозный фильтр занимает 2-3 часа. Следует заметить, что короткие фрагменты ДНК на нитроцел-люлозном фильтре задерживаются плохо. Если это существенно, то лучше использовать фильтры из так называемой, «диазобума-ги» или «ДБМ-бумаги». Фирма Ватман выпускает ее под наименованием «Whatman 540».

Литература

1 Курашвили Л.В. Нарушения, липидного обмена при состояниях напряжения. II Захарьинские чтения. Тезисы докладов. - 1995. -С.127.

2 Курашвили Л.В. Активность липазы и ЛХАТ при длительном обезвоживании. В кн.: Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных. Тезисы докладов. - Пенза, 1995. -С.71-72.

3 Курашвили Л.В. Фосфолипидный статус при нарушении водно-электролитного обмена. В кн.: Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных. Тезисы докладов. - Пенза, 1995.-С.69-70.