Pri tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti (HPLC) je narava procesov, ki potekajo v kromatografski koloni, na splošno enaka procesom v plinski kromatografiji. Razlika je le v uporabi tekočine kot stacionarne faze. Zaradi velike gostote tekočih mobilnih faz in velikega upora kolon se plinska in tekočinska kromatografija močno razlikujeta po instrumentaciji.
Pri HPLC se kot mobilne faze običajno uporabljajo čista topila ali njihove mešanice.
Za ustvarjanje toka čistega topila (ali zmesi topil), imenovanega eluent v tekočinski kromatografiji, se uporabljajo črpalke, ki so del hidravličnega sistema kromatografa.
Adsorpcijska kromatografija se izvede kot posledica interakcije snovi z adsorbenti, kot sta silikagel ali aluminijev oksid, ki imajo aktivna središča na površini. Razlika v sposobnosti interakcije z adsorpcijskimi centri različnih molekul vzorca vodi do njihove ločitve na cone v procesu premikanja z mobilno fazo skozi kolono. V tem primeru dosežena razdelitev komponentnih con je odvisna od interakcije s topilom in adsorbentom.
Silikagelni adsorbenti z različnimi volumni, površinami in premeri por najdejo največjo uporabo v HPLC. Aluminijev oksid in drugi adsorbenti se uporabljajo veliko manj pogosto. Glavni razlog za to:
nezadostna mehanska trdnost, ki ne omogoča pakiranja in uporabe pri povišanih tlakih, značilnih za HPLC;
silikagel ima v primerjavi z aluminijevim oksidom širši razpon poroznosti, površine in premera por; bistveno višja katalitična aktivnost aluminijevega oksida povzroči izkrivljanje rezultatov analize zaradi razgradnje komponent vzorca ali njihove ireverzibilne kemisorpcije.
HPLC detektorji
Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) se uporablja za odkrivanje polarnih nehlapnih snovi, ki jih iz nekega razloga ni mogoče pretvoriti v obliko, primerno za plinsko kromatografijo, niti v obliki derivatov. Med takšne snovi sodijo zlasti sulfonske kisline, vodotopna barvila in nekateri pesticidi, kot so derivati fenilsečnine.
Detektorji:
Detektor z UV diodami. »Matrika« fotodiod (teh je več kot dvesto) konstantno registrira signale v UV in vidnem delu spektra ter tako zagotavlja snemanje UV-B spektrov v načinu skeniranja. To omogoča neprekinjeno snemanje, pri visoki občutljivosti, nepopačenih spektrov komponent, ki hitro prehajajo skozi posebno celico.
V primerjavi z detekcijo z eno valovno dolžino, ki ne zagotavlja informacij o "čistosti" vrha, zmožnost primerjave celotnega spektra niza diod zagotavlja rezultat identifikacije z veliko večjo stopnjo gotovosti.
Fluorescentni detektor. Velika priljubljenost fluorescenčnih detektorjev je posledica zelo visoke selektivnosti in občutljivosti ter dejstva, da številni onesnaževalci okolja fluorescirajo (na primer poliaromatski ogljikovodiki).
Elektrokemični detektor Uporabljajo se za odkrivanje snovi, ki se zlahka oksidirajo ali reducirajo: fenoli, merkaptani, amini, aromatski nitro in halogenski derivati, aldehidi, ketoni, benzidini.
Kromatografsko ločevanje zmesi na koloni zaradi počasnega napredovanja PF traja dolgo časa. Za pospešitev postopka se kromatografija izvaja pod pritiskom. Ta metoda se imenuje tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC).
Posodobitev opreme, ki se uporablja pri klasični tekočinski kolonski kromatografiji, jo je uvrstila med obetavne in sodobne metode analize. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti je priročna metoda za ločevanje, preparativno izolacijo in izvajanje kvalitativne in kvantitativne analize nehlapnih termolabilnih spojin z nizko in visoko molekulsko maso.
Odvisno od vrste sorbenta, ki se uporablja pri tej metodi, se uporabljata 2 različici kromatografije: na polarnem sorbentu z uporabo nepolarnega eluenta (možnost neposredne faze) in na nepolarnem sorbentu z uporabo polarnega eluenta - tako imenovana reverzna kromatografija. -fazna tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (RPHLC).
Ko eluent prehaja v eluent, se ravnotežje v pogojih RPHLC vzpostavi mnogokrat hitreje kot v pogojih polarnih sorbentov in nevodnih PF. Zaradi tega, kot tudi priročnosti dela z vodo in vodno-alkoholnimi eluenti, je RPHLC zdaj pridobil veliko popularnost. Večina analiz HPLC se izvaja s to metodo.
Detektorji. Registracija izhoda iz stolpca ločene komponente se izvede z detektorjem. Za registracijo lahko uporabite spremembo katerega koli analitičnega signala, ki prihaja iz mobilne faze in je povezan z naravo in količino komponente mešanice. Tekočinska kromatografija uporablja takšne analitične signale, kot so absorpcija ali emisija svetlobe izstopajoče raztopine (fotometrični in fluorimetrični detektorji), lomni količnik (refraktometrični detektorji), potencial in električna prevodnost (elektrokemični detektorji) itd.
Nenehno zaznan signal snemalnik posname. Kromatogram je zaporedje detektorskih signalov, posnetih na snemalni trak, ki nastanejo, ko posamezne komponente zmesi zapustijo kolono. V primeru ločevanja zmesi so na zunanjem kromatogramu vidni posamezni vrhovi. Položaj vrha na kromatogramu se uporablja za identifikacijo snovi, višina ali površina vrha - za kvantitativno določitev.
(OFS 42-0096-09)
Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) je metoda kolonske kromatografije, pri kateri je mobilna faza (MP) tekoča.
kost, ki se premika skozi kromatografsko kolono, napolnjeno z nepodprto
vidna faza (sorbent). Za kolone HPLC je značilen visok hidravlični tlak na vstopu v kolono, zato se včasih imenuje HPLC
imenovano "High Pressure Liquid Chromatography".
Glede na mehanizem ločevanja snovi ločimo:
splošne možnosti HPLC: adsorpcija, distribucija, ionska izmenjava,
ekskluzivni, kiralni itd.
Pri adsorpcijski kromatografiji pride do ločevanja snovi zaradi njihove različne sposobnosti adsorpcije in desorpcije z naraščanjem
površina adsorbenta z razvito površino, na primer silikagel.
Pri razdelitveni HPLC pride do ločevanja zaradi razlike v porazdelitvenih koeficientih snovi, ki jih je treba ločiti med nepremičnimi
(običajno kemično cepljen na površino fiksnega nosilca) in
mobilne faze.
Glede na polarnost PF in NF HPLC delimo na normalnofazno in ob-
fazna rotacija.
Normalna faza se imenuje različica kromatografije, pri kateri
uporabite polarni sorbent (na primer silikagel ali silikagel z dodanim
zvite skupine NH2 - ali CN) in nepolarni PF (na primer heksan z različnimi
osebni dodatki). V različici kromatografije z reverzno fazo,
uporabite nepolarne kemično modificirane sorbente (npr.
nepolarni alkilni radikal C18) in polarne mobilne faze (npr.
metanol, acetonitril).
Pri ionsko izmenjevalni kromatografiji molekule snovi zmesi, disociacija
v raztopini na katione in anione, se med premikanjem ločijo
sorbent (kationski izmenjevalec ali anionski izmenjevalec) zaradi različnih menjalnih razmerij z ionskimi
mi skupine sorbentov.
Izključeno (sito, gel-penetracija, gel-filtracija)
Kromatografske molekule snovi ločimo po velikosti zaradi njihove različne sposobnosti prodiranja v pore stacionarne faze. Hkrati je prvi od
največje molekule (z največjo molekulsko maso), ki lahko prodrejo v najmanjše število por stacionarne faze, izstopijo iz kolon,
in snovi z majhnimi molekulskimi velikostmi pridejo ven zadnje.
Pogosto ločitev ne poteka z enim, ampak z več mehanizmi hkrati.
Metoda HPLC se lahko uporablja za nadzor kakovosti katerega koli negativnega
podobni analiti. Za analizo se uporabljajo ustrezni instrumenti - tekočinski kromatografi.
Sestava tekočinskega kromatografa običajno vključuje naslednje osnovne
vozlišča:
– Enota za pripravo PF, vključno s posodo z mobilno fazo (oz
sti s posameznimi topili, ki so del mobilne faze
zy) in sistem za odplinjevanje PF;
– črpalni sistem;
– mešalnik mobilne faze (če je potrebno);
– sistem za vbrizgavanje vzorca (injektor);
– kromatografska kolona (lahko se namesti v termostat);
– detektor;
– sistem zbiranja in obdelave podatkov.
Črpalni sistem
Črpalke dovajajo PF v kolono z določeno konstantno hitrostjo. Sestava mobilne faze je lahko konstantna ali spremenljiva.
med analizo. V prvem primeru se proces imenuje izokratski,
in v drugem - gradient. Včasih je nameščen pred črpalnim sistemom
filtri s premerom por 0,45 µm za filtriranje mobilne faze. Moderno
Spremenljivi črpalni sistem tekočinskega kromatografa je sestavljen iz ene ali več črpalk, ki jih krmili računalnik. To vam omogoča spreminjanje
postajajo PF po posebnem programu z gradientno elucijo. Sme-
mešanje komponent PF v mešalniku lahko poteka tako pri nizkem tlaku
ion (pred črpalkami) in pri visokem tlaku (po črpalkah). Mešalnik se lahko uporablja za pripravo PF in izokratsko elucijo,
natančnejše razmerje komponent pa dosežemo s predhodnim
mešanje komponent PF za izokratski proces. Črpalke za analitično HPLC omogočajo vzdrževanje konstantnega pretoka PF v kolono v območju od 0,1 do 10 ml/min pri vstopnem tlaku v kolono do 50 MPa. Vendar je priporočljivo, da te vrednosti ne presežete
shalo 20 MPa. Nizke tlaka so zmanjšane s posebnim dušenjem
sistemi obročkov, ki so vključeni v zasnovo črpalk. Delovni deli na-
Črpalke so izdelane iz materialov, odpornih proti koroziji, kar omogoča uporabo agresivnih komponent v sestavi PF.
Pipe
Po zasnovi so mešalniki lahko statični ali dinamični.
mikrofon
V mešalniku nastane ena sama mobilna faza iz
posebna topila, ki jih dovajajo črpalke, če zahtevana mešanica ni bila pripravljena vnaprej. Mešanje topil običajno poteka spontano, včasih pa se uporabljajo sistemi s prisilnim mešanjem.
šivanje.
Injektorji
Injektorji so lahko univerzalni za vnašanje vzorcev iz
1 µl do 2 ml ali diskretno za vbrizgavanje vzorca le določene prostornine
ema. Obe vrsti injektorjev sta lahko avtomatski ("samoinjektorji" ali "samodejni vzorčevalci"). Injektor za vnos vzorca (raztopine) se nahaja ne -
tik pred kromatografsko kolono. Zasnova injektorja omogoča spreminjanje smeri toka PF in predhodno vnašanje vzorca v zanko določene prostornine (običajno od 10 do 100 μl).
Ta prostornina je navedena na nalepki zanke. Zasnova injektorja omogoča zamenjavo zanke. Za uvedbo analizirane raztopine v neav-
tomatski injektor uporablja ročno mikrobrizgalko s precejšnjim volumnom
močno presega prostornino zanke. Presežek vbrizgane raztopine, ne
v zanki se zavrže in v kolono se vbrizga natančna in vedno enaka prostornina vzorca. Ročno nepopolno polnjenje zanke zmanjša natančnost
natančnost in ponovljivost odmerjanja ter posledično poslabša natančnost
in ponovljivost kromatografske analize.
Kromatografska kolona
Kromatografske kolone so običajno cevi iz nerjavnega jekla, stekla ali plastike, napolnjene s sorbentom in zaprte.
na obeh straneh s filtri s premerom por 2–5 µm. Dolžina analitičnega
kolona, odvisno od mehanizma kromatografskega ločevanja, je lahko v območju od 5 do 60 cm ali več (običajno je
10-25 cm), notranji premer - od 2 do 10 mm (običajno 4,6 mm). V krom mikrokoloni se uporabljajo kolone z notranjim premerom manj kot 2 mm
tografija. Uporabljajo se tudi kapilarne kolone z notranjim premerom.
rum približno 0,3-0,7 mm. Kolone za preparativno kromatografijo imajo notranji premer do 50 mm ali več.
Pred analitično kolono se lahko namestijo kratki kabli.
stolpci (predstolpci), ki opravljajo različne pomožne funkcije
(pogosteje - zaščita analitičnega stolpca). Običajno se analiza izvaja pri
pri sobni temperaturi pa povečati učinkovitost ločevanja in
skrajša trajanje analize, lahko uporabimo termostat
utrujanje kolone pri temperaturah, ki ne presegajo 60 C. Pri višjih temperaturah je možna razgradnja sorbenta in sprememba sestave PF.
Stacionarna faza (sorbent)
Najpogosteje uporabljeni sorbenti so:
1. Silikagel, aluminijev oksid, porozni grafit se običajno uporabljajo
malofazna kromatografija. Zadrževalni mehanizem v tem primeru
čaj - običajno adsorpcija;
2. Smole ali polimeri s kislimi ali bazičnimi skupinami. Področje uporabe - ionsko izmenjevalna kromatografija;
3. Porozni silikagel ali polimeri (izključitvena kromatografija);
4. Kemično modificirani sorbenti (sorbenti s cepljenimi fa-
zami), pripravljen najpogosteje na osnovi silikagela. Mehanizem zadrževanja je v večini primerov porazdelitev med mobilnimi
noah in stacionarne faze;
5. Kemično modificirani kiralni sorbenti, npr.
vodne celuloze in amiloze, proteini in peptidi, ciklodekstrini,
uporablja se za ločevanje enantiomerov (kiralna kromatografija)
Sorbenti vezane faze imajo lahko različne stopnje kemije
chesky sprememba. Delci sorbenta so lahko sferični ali nesferični.
pravilne oblike in raznolike poroznosti.
Najpogosteje uporabljene vezane faze so:
– oktilne skupine(sorbent oktilsilan ali C8);
– oktadecilne skupine(sorbent oktadecilsilan
(ODS) ali C18);
– fenilne skupine(sorbent fenilsilan);
– cianopropilne skupine(sorbent CN);
– aminopropilne skupine(sorbent NH2);
– diolne skupine (sorbent diol).
Najpogosteje se analiza izvaja na nepolarno vezanih fazah v
način obratne faze z uporabo sorbenta C18.
V nekaterih primerih je bolj primerno uporabiti običajno
fazna kromatografija. V tem primeru se uporabi silikagel ali polarne vezane faze (»CN«, »NH2«, »diol«) v kombinaciji z nepolarnimi topljenci.
Sorbenti vezane faze so kemično stabilni pri pH vrednostih od 2,0 do 8,0, razen če proizvajalec ne določi drugače.
Delci sorbenta imajo lahko sferično ali nepravilno obliko in različno poroznost. Velikost delcev sorbenta pri analizni HPLC je običajno 3–10 µm, pri preparativni HPLC pa do 50 µm ali več.
Uporabljajo se tudi monolitni sorbenti.
Visoko učinkovitost ločevanja zagotavlja velika površina delcev sorbenta (kar je posledica njihove mikroskopije).
prisotnost por), pa tudi enotnost sestave sorbenta in njegovo gosto in enakomerno pakiranje.
Detektorji
Uporabljajo se različne metode odkrivanja. V splošnem primeru PF z v njem raztopljenimi komponentami po kromatografski koloni
ki pade v detektorsko celico, kjer se sproti meri ena ali druga njegova lastnost (absorpcija v UV ali vidnem delu spektra, fluorescenca,
lomni količnik, električna prevodnost itd.). Nastali kromatogram je graf odvisnosti nekaterih fizikalnih
ali fizikalno-kemijski parameter PF pravočasno.
Najpogostejši so spektrofotometrični
detektorji (vključno z diodno matriko), ki registrirajo spremembo optičnega
gostota v ultravijoličnem, vidnem in pogosto v bližnjem infrardečem
druga področja spektra od 190 do 800 ali 900 nm. Kromatogram v tem primeru
čaj je odvisnost optične gostote PF od časa.
Tradicionalno uporabljen spektrofotometrični detektor omogoča
omogoča zaznavanje pri kateri koli valovni dolžini v njegovem območju delovanja
območje. Uporabljajo se tudi večvalovni detektorji, ki omogočajo prevajanje
izvajajo detekcijo na več valovnih dolžinah hkrati.
S pomočjo detektorja diodnih nizov je mogoče ne samo izvesti detekcijo na več valovnih dolžinah hkrati, ampak tudi skoraj v trenutku
kadarkoli je mogoče (brez skeniranja) pridobiti optični spekter PF, kar močno poenostavi kvalitativno analizo ločenih komponent
komponente.
Občutljivost fluorescenčnih detektorjev je približno 1000-krat višja od spektrofotometričnih. V tem primeru se uporabi lastna fluorescenca ali fluorescenca ustreznih derivatov, če sam analit ne fluorescira. Moderno
Izmenljivi fluorescenčni detektorji omogočajo ne le pridobivanje kromato-
gramov, ampak tudi za snemanje ekscitacijskih in fluorescenčnih spektrov anali-
zyable povezave.
Refraktometrični detektorji se uporabljajo za analizo vzorcev, ki ne absorbirajo v UV in vidnem delu spektra (na primer ogljikovi hidrati).
(refraktometri). Slabosti teh detektorjev so nizka (v primerjavi s spektrofotometričnimi) občutljivost in velika temperaturna odvisnost jakosti signala (detektor mora biti termostatiran).
Uporabljajo se tudi elektrokemični detektorji (konduktometrični
nebo, amperometrija itd.), masna spektrometrija in Fourier-IR
detektorji, detektorji sipanja svetlobe, radioaktivnosti in nekateri drugi
mobilna faza
IN Kot PF se lahko uporabljajo različna topila, tako posamezna kot njihove mešanice.
IN normalna faza Kromatografija običajno uporablja tekoči ogljik
ogljikovodiki (heksan, cikloheksan, heptan) in drugi relativno nepolarni
topila z majhnimi dodatki polarnih organskih spojin,
ki uravnavajo moč eluiranja PF.
Pri kromatografiji z reverzno fazo sestava PF vključuje polarne oz.
organska topila (običajno acetonitril in metanol) in vodo. Za opti-
Študije ločevanja pogosto uporabljajo vodne raztopine z določenim predznakom
pH vrednost, zlasti puferske raztopine. Uporabljajo se anorganski dodatki
kalcijeve in organske kisline, baze in soli ter druge spojine (na-
na primer kiralni modifikatorji za ločevanje enantiomerov na akiralne
nom sorbent).
Kontrolo vrednosti pH je treba izvajati ločeno za vodno komponento in ne za njeno mešanico z organskim topilom.
PF je lahko sestavljen iz enega topila, pogosto dveh, če je potrebno
dimity - od treh ali več. Sestava PF je navedena kot prostorninsko razmerje njegovih sestavnih topil. V nekaterih primerih masa
razmerje, ki mora biti posebej določeno.
Pri uporabi UV spektrofotometričnega detektorja PF ne sme imeti izrazite absorpcije pri valovni dolžini, izbrani za detekcijo. Meja prosojnosti oziroma optične gostote pri določanju
pogosto je navedena določena valovna dolžina topila določenega proizvajalca
je na paketu.
Na kromatografsko analizo močno vpliva stopnja čistosti PF, zato je bolje uporabiti proizvedena topila
nye posebej za tekočinsko kromatografijo (vključno z vodo).
PF in analizirane raztopine ne smejo vsebovati neraztopljenih
delci in plinski mehurčki. Voda pridobljena v laboratoriju
vodne raztopine, predhodno pomešane z vodnimi organskimi topili
Topila, kot tudi analizirane raztopine, morajo biti podvržene fini filtraciji in razplinjevanju. V ta namen se običajno uporablja filtriranje.
pod vakuumom skozi membranski filter, ki je inerten glede na to topilo ali raztopino z velikostjo por 0,45 μm.
Sistem zbiranja in obdelave podatkov
Sodoben sistem za obdelavo podatkov je konjugiran
osebni računalnik, povezan s kromatografom, z nameščeno programsko opremo
programska oprema, ki vam omogoča registracijo in obdelavo krono-
matogram, pa tudi upravljati delovanje kromatografa in spremljati glavni
mi parametrov kromatografskega sistema.
Seznam kromatografskih pogojev, ki jih je treba določiti
V zasebni monografiji so razsežnosti so-
kolone, vrsta sorbenta z navedbo velikosti delcev, temperatura kolone (če je potrebna kontrola temperature), volumen vbrizganega vzorca (volumen zanke),
Stanje PF in metoda njegove priprave, hitrost dovajanja PF, detektor in pogoji detekcije, opis načina gradienta (če se uporablja), čas kromatografije.
IONSKA IZMENJAVA IN IONSKA HPLC
Ionsko izmenjevalna kromatografija se uporablja za analizo kot organska
skikh (heterociklične baze, aminokisline, proteini itd.) in ne-ali-
ganske (različni kationi in anioni) spojine. Ločevanje komponent
komponent analizirane zmesi pri ionsko izmenjevalni kromatografiji temelji na reverzibilni interakciji ionov analiziranih snovi z ionskimi skupinami.
pami sorbent. Kot sorbenti se uporabljajo anionski ali kationski izmenjevalci.
Ti. Ti sorbenti so večinoma polimerni ionski
izmenjevalne smole (običajno kopolimeri stirena in divinilbenzena s cepičem
ionske skupine) ali silikageli s cepljenimi ionskimi izmenjevalnimi skupinami. Za ločevanje anionov se uporabljajo sorbenti s skupinami -(CH2)3 N+ X–, za ločevanje kationov pa sorbenti s skupinami -(CH2)SO3 – H+.
Običajno se polimerne smole uporabljajo za ločevanje anionov in za ločevanje e-
kationi so modificirani silikageli.
Kot PF v ionsko izmenjevalni kromatografiji se uporabljajo vodne raztopine kislin, baz in soli. Običajno se uporabljajo medmesne dirke
raztopine, ki vam omogočajo vzdrževanje določenih pH vrednosti. Možna je tudi uporaba majhnih dodatkov organske snovi, ki se meša z vodo
kalorična topila - acetonitril, metanol, etanol, tetrahidrofuran.
Ionska kromatografija- različica ionsko izmenjevalne kromatografije, v
ki se uporablja za določanje koncentracije ionov analita
z uporabo konduktometričnega detektorja. Za zelo občutljive op-
Za določitev sprememb v električni prevodnosti, ki prehaja skozi detektor PF, mora biti električna prevodnost ozadja PF nizka.
Obstajata dve glavni različici ionske kromatografije.
Prvi od njih temelji na zatiranju električne prevodnosti elektrolita
da PF uporablja drugo ionsko izmenjevalno kolono, ki se nahaja med anal-
litična kolona in detektor. V tem stolpcu poteka nevtralizacija
PF in analizirane spojine vstopijo v detektorsko celico pri deionizaciji
zirovannoy vodo. Zaznani ioni so edini ioni
zagotavljanje prevodnosti PF. Pomanjkljivost dušilnega stolpca je potreba po njegovi regeneraciji v dokaj kratkih intervalih.
jaz. Dusilni stolpec je mogoče zamenjati z neprekinjenim delovanjem
membranski supresor, pri katerem je sestava membrane neprekinjena
je tok regeneracijske raztopine, ki se giblje v smeri
nasproti smeri toka PF.
Druga različica ionske kromatografije je ionska kromatografija z eno kolono.
matografija. V tej varianti se uporablja PF z zelo nizko električno prevodnostjo.
vsebnost vode. Šibke organske spojine se pogosto uporabljajo kot elektroliti.
nebo kisline - benzojska, salicilna ali izoftalna.
VELIKOSTI HPLC
Velikostno izključitvena kromatografija (gelska kromatografija) je posebna različica HPLC, ki temelji na ločevanju molekul glede na njihovo velikost. Distribucija
molekul med stacionarno in mobilno fazo temelji na velikosti mo-
molekul in deloma na njihovo obliko in polarnost. Za ločevanje uporabite
porozni sorbenti - polimeri, silikagel, porozna stekla in polisaharidi.
Velikost delcev sorbentov je 5–10 µm.
Prednosti poroznih stekel in silikagela so hitra difuzija PF in molekul analita v pore, stabilnost v različnih pogojih (tudi pri visokih temperaturah). Polimerni sorbeni-
ste kopolimeri stirena in divinilbenzena (to je hidro-
fobični sorbenti, ki se uporabljajo z nepolarnimi mobilnimi fazami) in
hidrofilni geli, pridobljeni iz sulfoniranih divinilbenzenskih ali poliakrilamidnih smol.
Možni sta dve mejni vrsti interakcije molekul s porozno stacionarno fazo. Molekule, večje od povprečnega premera pore, sploh ne prodrejo v sorbent in se eluirajo skupaj z mobilno fazo.
najprej zoy. Molekule s premerom, ki je veliko manjši od velikosti por vrste
benti prosto prodrejo vanj, najdlje ostanejo v stacionarni fazi in se izločijo zadnji. Molekule srednje velikosti prodrejo v pore sorbenta glede na njihovo velikost in delno glede na obliko. Eluirajo z različnimi retenzijskimi časi med njimi
naše največje in najmanjše molekule. Do ločevanja komponent kromatografiranega vzorca pride zaradi ponavljajočih se
difuzijo komponent vzorca v pore sorbenta in obratno.
Pri kromatografiji za izločitev velikosti za karakterizacijo retencije,
uporabi se zadrževalni volumen, ki je enak produktu stopnje pretoka PF in zadrževalnega časa.
mobilna faza. Izbira PF je odvisna od vrste sorbenta. Izključitev-
kromatografijo na splošno delimo na gelsko filtracijo in gelsko kromatografijo.
permeacijska kromatografija.
Za ločevanje se uporablja metoda gelske filtracijske kromatografije
vodotopnih spojin na hidrofilnih sorbentih. Mobilne faze so vodne pufrske raztopine z določeno pH vrednostjo.
Gel permeacijska kromatografija uporablja hidrofobne
bentov in nepolarnih organskih topil (toluen, diklorometan, tetra-
hidrofuran). Ta metoda se uporablja za analizo spojin, ki so rahlo topne
obrobljen v vodi.
Detektorji. Kot detektorji v velikostni izključitveni kromatografiji se uporabljajo diferencialni refraktometrični detektorji, pa tudi spektrofotometrični detektorji (vključno s tistimi v IR območju spektra).
Uporabljajo se tudi viskozimetrični in pretočni laserski detektorji.
Ti detektorji, v kombinaciji z refraktometrom ali drugo koncentracijo
detektor vam omogoča neprekinjeno določanje molekulske mase
limer v PF.
ULTRA TEKOČINA KROMATOGRAFIJA
Tekočinska kromatografija ultrazmogljivosti je različica tekočinske kromatografije, ki je učinkovitejša
stu v primerjavi s klasično HPLC.
Značilnost tekočinske kromatografije z izjemno zmogljivostjo je
uporaba sorbentov z velikostjo delcev od 1,5 do 2 mikrona. Kro-
matografski stolpci so običajno dolgi od 50 do 150 mm in 1
do 4 mm v premeru. Volumen vbrizganega vzorca je lahko od 1 do 50 µl.
Kromatografska oprema, ki se uporablja v klasični
riante HPLC, običajno posebej prilagojen za to vrsto kromatografije
Oprema, zasnovana za tekočinsko kromatografijo ultra zmogljivosti, se lahko uporablja tudi v klasični različici HPLC.
Tekočinska kromatografija
Tekočinska kromatografija je vrsta kromatografije, pri kateri mobilna faza, ki se imenuje eluent, je tekočina. Stacionarna faza Mogoče trdni sorbent, trden nosilec s tekočino, nanešeno na njegovo površino oz gel.
Razlikovati stebrast in tanek sloj tekočinska kromatografija. V kolonski različici gre del mešanice snovi, ki jih je treba ločiti, skozi kolono, napolnjeno s stacionarno fazo v toku eluenta, ki se premika pod pritiskom ali pod delovanjem gravitacije. Pri tankoplastni kromatografiji se eluent pod delovanjem kapilarnih sil premika vzdolž ravnega sloja sorbenta, nanesenega na stekleno ploščo ali kovinsko folijo, vzdolž poroznega polimernega filma ali vzdolž traku posebnega kromatografskega papirja. Razvita je bila tudi metoda tankoplastne tekočinske kromatografije pod pritiskom, ko eluent prečrpamo skozi plast sorbenta, stisnjenega med plošče.
Poznamo več vrst tekočinske kromatografije, kot npr analitično(za analizo zmesi snovi) in pripravljalno(za izolacijo čistih komponent).
Razlikovati tekočinska kromatografija (LC) v klasični različici, izvedeni ob zračni tlak, In visoka hitrost) izvedeno ob visok krvni pritisk. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) uporablja kolone s premerom do 5 mm, gosto napolnjene s sorbentom z majhnimi delci (3-10 µm). Za črpanje eluenta skozi kolono se uporablja tlak do 3,107 Pa. Ta vrsta kromatografije se imenuje visokotlačna kromatografija. Prehod eluenta skozi kolono pod visokim pritiskom omogoča močno povečanje hitrosti analize in znatno povečanje učinkovitosti ločevanja zaradi uporabe fino dispergiranega sorbenta.
Možnosti HPLC so mikrokolonska kromatografija na kolonah majhnega premera, napolnjenih s sorbentom in kapilarna kromatografija na votlih in s sorbentom napolnjenih kapilarnih kolonah. Metoda HPLC trenutno omogoča izolacijo, kvantitativno in kvalitativno analizo kompleksnih mešanic organskih spojin.
Tekočinska kromatografija je najpomembnejša fizikalno-kemijska raziskovalna metoda v kemiji, biologiji, biokemiji, medicini in biotehnologiji. Uporablja se za:
preučevanje presnovnih procesov v živih organizmih zdravil;
diagnostika v medicini;
· analiza produktov kemijske in petrokemične sinteze, polizdelkov, barvil, goriv, maziv, olja, odplak;
· proučevanje izoterm sorpcije iz raztopine, kinetike in selektivnosti kemijskih procesov;
izbor
analiza in ločevanje zmesi, njihovo čiščenje in izolacija številnih bioloških snovi, kot so aminokisline, proteini, encimi, virusi, nukleinske kisline, ogljikovi hidrati, lipidi, hormoni.
V kemiji makromolekulskih spojin in pri proizvodnji polimerov se tekočinska kromatografija uporablja za analizo kakovosti monomerov, proučevanje porazdelitve molekulske mase in porazdelitve po vrstah funkcionalnosti oligomerov in polimerov, kar je potrebno za kontrolo produkta.
Tekočinska kromatografija se uporablja tudi v parfumeriji, prehrambeni industriji, za analizo onesnaženosti okolja in v forenziki.
Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) je bila razvita in predstavljena sredi sedemdesetih let prejšnjega stoletja. Nato so se pojavili prvi tekočinski kromatografi.
Tekočinska kromatografija je optimalna metoda za analizo kemijsko in termično nestabilnih molekul, makromolekularnih snovi z zmanjšano hlapnostjo. To je mogoče pojasniti s posebno vlogo mobilne faze v LC, v nasprotju s plinsko kromatografijo: eluent ne opravlja samo transportne funkcije.
2. Osnovni pojmi in razvrstitev metod tekočinske kromatografije.
Avtor: mehanizem zadrževanja ločenih snovi s stacionarno fazo LC razlikovati:
- sedimentna kromatografija, ki temelji na različni topnosti oborin, ki nastanejo pri interakciji komponent analizirane mešanice z oborino. Prednost metode je, da imajo nastale cone vzdolž sorbenta ostre meje, vsebujejo usedline samo ene snovi in so pogosto ločene s conami čistega sorbenta. Vendar ta metoda še ni našla široke razširjenosti.
· adsorpcijska kromatografija , pri katerem se ločevanje izvede kot posledica interakcije ločene snovi z adsorbent kot je aluminijev oksid ali silikagel, imeti na površini aktivna polarna središča. Topilo(eluent) - nepolarna tekočina.
riž. Shema za ločevanje zmesi snovi z adsorpcijsko kromatografijo
http://www. xumuk. en/biologhim/bio/img014.jpg
Mehanizem sorpcije je sestavljen iz specifične interakcije med polarno površino sorbenta in polarnimi (ali sposobnimi za polarizacijo) območji molekul analizirane komponente (slika). Do interakcije pride zaradi donorske in akceptorske interakcije oziroma tvorbe vodikovih vezi.
riž. Shema adsorpcijske tekočinske kromatografije
https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg" width="219" height="200">
riž. . Porazdelitvena kromatografija z vezano fazo (različica normalne faze).
http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html
pri normalno-faza V različici porazdelitvene tekočinske kromatografije se kot površinski modifikatorji silikagela (vezane faze) uporabljajo substituirani alkilklorosilani, ki vsebujejo polarne skupine, kot so nitril, amino itd. (slika). Uporaba vezanih faz omogoča fino kontrolo sorpcijskih lastnosti površine stacionarne faze in doseganje visoke učinkovitosti ločevanja.
obrnjena faza tekočinska kromatografija temelji na porazdelitvi komponent zmesi med polarnim eluentom in nepolarnimi skupinami (dolge alkilne verige), cepljenimi na površino sorbenta (slika). Manj pogosto se uporablja različica tekočinske kromatografije s podprto fazo, ko se tekoča stacionarna faza nanese na stacionarni nosilec.
riž. . Porazdelitvena kromatografija z vezano fazo (različica z reverzno fazo). http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html
Porazdelitvena tekočinska kromatografija vključuje ekstrakcijska tekočina kromatografija, pri katerem je stacionarna faza organski ekstraktant, nanesen na trden nosilec, mobilna faza pa je vodna raztopina spojin, ki jih je treba ločiti. Primerni ekstrakti so npr. fenoli, trialkilfosfati, amini, kvaterne amonijeve baze in organofosforne spojine, ki vsebujejo žveplo. Ekstrakcijska tekočinska kromatografija se uporablja za ločevanje in koncentriranje anorganskih spojin, kot so ioni alkalijskih kovin, aktinidi in drugi podobni elementi pri predelavi izrabljenega jedrskega goriva.
- ionsko izmenjevalna kromatografija, ki temelji na reverzibilni stehiometrični izmenjavi ionov v analizirani raztopini za mobilne ione, ki so del ionski izmenjevalci. Ionske izmenjevalce delimo glede na znak naboja ionizirajočih skupin kationski izmenjevalci in anionski izmenjevalci. Tukaj so tudi amfoterni ionski izmenjevalci –amfoliti, ki lahko hkrati izmenjujejo katione in anione. Ionsko izmenjevalna kromatografija se uporablja samo za ločevanje nabitih delcev. Ločevanje temelji na sposobnosti ionske izmenjevalne smole, da zadrži različne ione z različnimi močmi. Ionit sestoji iz polimernega matriksa in z njim povezanih aktivnih skupin, ki so sposobne izmenjevati ione. kationski izmenjevalec ima kisle ali šibko kisle lastnosti, saj vključuje skupine: - SO3H, -CH2SO3H, - COOH, - PO3H2 in druge, v katerih so vodikovi ioni mobilni. anionski izmenjevalci imajo bazične ali šibko bazične lastnosti in vsebujejo skupine: = NH2, - NH2, -NR3 +, -OH in druge. Ločevanje ionov se nadzoruje z izbiro optimalnih pH vrednosti eluenta in njegove ionske moči. Shematično lahko ionsko izmenjavo predstavimo z reakcijami:
R-H + Na+ + Cl - → R-Na + H+ + Cl - (kationska izmenjava)
R-OH + Na+ + Сl - → R-Сl + Na+ + OH - (anionska izmenjava)
Ionski izmenjevalci morajo izpolnjevati naslednje zahteve: biti morajo kemično stabilni v različnih okoljih, mehansko močni v suhem in predvsem v nabreklem stanju, imeti visoko absorpcijsko sposobnost in sposobnost dobre regeneracije.
Pri ionski izmenjevalni (ionski) kromatografiji se ločeni anioni (kationi) zaznajo kot kisline (ustrezne baze) z visoko občutljivim konduktometričnim detektorjem, kjer so visokozmogljive kolone napolnjene s površinsko aktivnim ionskim izmenjevalnikom z majhno kapaciteto.
- kromatografija ionskih parov, ki ga lahko obravnavamo kot kombinacijo adsorpcijske in ionsko izmenjevalne kromatografije. Metoda temelji na ekstrakciji ionskih snovi – njihovem prenosu iz vodne faze v organsko fazo v obliki ionskih parov. Za to se mobilni fazi doda protiion, ki lahko selektivno reagira z analiziranimi komponentami in jih spremeni v kompleksne spojine s tvorbo ionskega para. Glavne prednosti te možnosti so, da je mogoče hkrati analizirati kisle, bazične in nevtralne snovi.
- kromatografija izmenjave ligandov temelji na različna sposobnost ločenih spojin, da tvorijo komplekse s kationi prehodnih kovin– Cu+2, Ni+2, Zn+2, Cd+2, Co+2 itd. - in fiksirne skupine (ligandi) stacionarne faze. Del koordinacijske sfere kovinskih ionov zasedajo molekule vode ali drugi šibki ligandi, ki jih lahko izpodrinejo molekule spojin, ki se ločujejo. Ta vrsta kromatografije se uporablja za ločevanje optičnih izomerov.
- velikostno izključitveno kromatografijo(sito, gel-penetracija, gel-filtracija), pri katerih temelji ločevanje razlike v velikosti molekul.
https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg" align="right" width="429" height="319">
riž. Shema gelske permeacijske kromatografije
- afinitetna kromatografija(biospecifična), ki temelji na dejstvu, da se lahko številne biološko aktivne makromolekule, na primer encimi, specifično vežejo na določen reagent. Reagent se fiksira na nosilec (pogosto agaroza), nato pa se spere z mešanico, ki jo je treba analizirati. Na polimeru se zadrži samo želena makromolekula (slika).
riž. Shema afinitetne kromatografije
http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html
Nato se odstrani iz polimera s prehodom raztopine spojine, ki ima še večjo afiniteto do makromolekule. Takšna kromatografija je še posebej učinkovita v biotehnologiji in biomedicini za izolacijo encimov, proteinov in hormonov.
odvisno na poti gibanja snovi Obstajajo naslednje vrste tekočinske kromatografije: razkrivajoče, frontalno in izpodrivanje.
Najpogosteje uporabljena demonstrativno različica, pri kateri se del zmesi, ki jo je treba ločiti, vnese v kolono v toku eluenta. Izhod komponent mešanice iz kolone se zabeleži na kromatogramu kot vrhovi. (riž.)
https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg" width="291" height="165">
riž. Shema razvijajoče se različice kromatografije
Višina oz območje vrha označuje koncentracija komponent, A potekala zvezki – kakovostna sestava mešanice. Identifikacija komponent se običajno izvaja s sovpadanjem retenzijskih časov s standardnimi snovmi, uporabljajo pa se tudi kemične ali fizikalno-kemijske metode.
pri čelni varianta (sl.) se mešanica snovi, ki jih je treba ločiti, neprekinjeno prenaša skozi kolono, ki igra vlogo mobilne faze. Posledično lahko dobimo v čisti obliki le tisto snov, ki je najmanj adsorbirana v koloni.
https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg" width="279" height="145">
riž. Shema sprednje variante kromatografije
Kromatogram je v tem primeru stopnica, katere višine so sorazmerne s koncentracijami komponent; retencijski volumni so določeni iz retenzijskih časov komponent. Pri diferenciaciji takšnega kromatograma dobimo sliko, podobno tisti, ki jo dobimo v razvijajoči se različici.
IN premik različica, komponente zmesi, vnesene v kolono, izpodrine eluent, ki se adsorbira močneje kot katera koli komponenta. Kot rezultat dobimo frakcije ločenih snovi, ki se nahajajo drug na drugem.Vrstni red sproščanja komponent je določen s silo njihove interakcije s površino sorbenta (slika).
https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg" width="320" height="175">
riž. Shema izpodrivne kromatografije
3. Osnovne kromatografske količine in njihovo določanje.
Pri ločevanju snovi s tekočinsko kromatografijo, kot je navedeno zgoraj, se lahko uporabijo možnosti razvijanja, frontalne in premestitvene možnosti. Najpogosteje se uporablja razvijalna varianta, pri kateri se del zmesi, ki jo je treba ločiti, vnese v kolono v toku eluenta. Izhod komponent mešanice iz kolone se zabeleži na kromatogramu kot vrhovi. Iz kromatograma (slika) določite:
- retenzijski časi nesorbiranja (t0), ločenih komponent (tR1, tR2, tR3 itd.); osnovna širina vrha (tw1, tw2 itd.).
https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif" width="61" height="24 src=">;
b) popravljen volumen zadrževanja komponent ,
Kje t "R- popravljen retencijski čas komponente;
c) razmerje kapacitivnosti stolpca glede na dano komponento 
;
d) učinkovitost kolone značilno število enakovrednih teoretičnih plošč
https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif" width="129" height="51 src=">;
f) dovoljenje https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif" width="203 height=51" height="51">
faktor kapacitivnosti k" pomembno vpliva na vrednost R S: pri menjavi k"od 0 do 10 (optimalne meje) R S se močno poveča. Pomen k" je določena z dvojno površino sorbenta in njegovo količino v koloni ter s konstanto adsorpcijskega ravnotežja (Henryjeva konstanta).
Faktor selektivnosti α je določena z razliko v adsorpcijskih ravnotežnih konstantah dveh ločenih komponent. Ko se α poveča (od 1 do ~5) R S se močno poveča, z nadaljnjim povečanjem α - se malo spremeni. Selektivnost kolone je odvisna od dejavnikov, kot so kemična struktura površine sorbenta, sestava eluenta, temperatura kolone in struktura spojin, ki jih je treba ločiti. Ker je sorpcija kromatografiranih snovi v tekočinski kromatografiji določena s parno interakcijo treh glavnih komponent sistema - sorbenta, snovi, ki jih je treba ločiti, in eluenta, je spreminjanje sestave eluenta priročen način za optimizacijo postopek ločevanja.
Učinkovitost stolpca je odvisna od velikosti delcev in strukture por adsorbenta, od enotnosti polnjenja kolone, viskoznosti eluenta in hitrosti prenosa mase. Podaljšanje kolone ne vodi vedno do izboljšanja ločevanja, saj se poveča upor kolone, povečata se tlak eluenta na vstopu in čas poskusa, zmanjšata se občutljivost in natančnost analize zaradi razširitve vrha analizirano komponento. Če , potem sta vrhova obeh snovi na kromatogramu skoraj popolnoma ločena. Z rastjo R S poveča čas ločitve. pri R S < 1 - nezadovoljiva ločitev. Pri preparativni kromatografiji zaradi vnosa relativno velikih količin ločljivih snovi deluje kolona s preobremenitvijo. V tem primeru se kapacitivni koeficient zmanjša, višina, ki je enaka teoretični krožnici, se poveča, kar vodi do zmanjšanja ločljivosti.
4. Adsorbenti
Kromatografsko ločevanje zmesi bo učinkovito, če sta adsorbent in topilo (eluent) pravilno izbrana.
Adsorbent ne sme kemično interagirati s komponentami, ki jih je treba ločiti, niti ne sme imeti katalitičnega učinka na topilo. Prav tako je potrebno, da ima adsorbent selektivnost glede na sestavine mešanice. Pravilno izbran adsorbent mora imeti največjo absorpcijsko sposobnost.
Razlikovati polarni (hidrofilni) in nepolarni (hidrofobni) adsorbenti. Ne smemo pozabiti, da je adsorpcijska afiniteta polarnih snovi za polarne sorbente veliko večja kot pri nepolarnih.
Kot adsorbenti se uporabljajo aluminijev oksid, aktivno oglje, silikagel, zeoliti, celuloza in nekateri minerali.
Aluminijev oksidAl2O3 – amfoterni adsorbent.(Sl.) Na njej mešanice lahko ločimo snovi v polar, in v nepolarnih topilih. Nevtralni aluminijev oksid se običajno uporablja za kromatografijo iz nevodnih raztopin nasičenih ogljikovodikov, aldehidov, alkoholov, fenolov, ketonov in etrov.
riž. Aluminijev oksid za kromatografijo
http://slike. /542857_w200_h200_product5.jpg
Aktivnost Al2O3 je odvisna od vsebnosti vlage v njem. Največjo aktivnost ima brezvodni aluminijev oksid. Pogojno se vzame kot enota. Po potrebi lahko pripravite aluminijev oksid z različno vsebnostjo vlage z mešanjem sveže pripravljenega aluminijevega oksida z vodo (Brockmannova lestvica).
Odvisnost aktivnosti aluminijevega oksida od vsebnosti vlage
Na primer, Al2O3 z aktivnostjo 1,5-2 se uporablja za ločevanje ogljikovodikov; za ločevanje alkoholov in ketonov - 2-3,5.
Specifična površina aluminijevega oksida je 230-380 m2/g.
silikagel(hidroksiliran ali kemično modificiran) je posušen želatinast silicijev dioksid, ki se pridobiva iz prenasičenih raztopin silicijeve kisline ( n SiO2 m H2O) pri pH > 5-6. (Sl.) Trden hidrofilni sorbent.
riž. silikagel
http://www. silikagel. /
http://silikagel. ru/images/askg. gif
Velikost delcev silikagela v analitskih kolonah je 3-10 µm, v preparativnih kolonah - 20-70 µm. Majhna velikost delcev poveča hitrost prenosa mase in izboljša učinkovitost kolone. Sodobne analitske kolone so dolge 10–25 cm. Polnjeni so s silikagelom z velikostjo delcev 5 mikronov in omogočajo ločevanje kompleksnih mešanic 20-30 komponent. Ko se velikost delcev zmanjša na 3–5 µm, se učinkovitost kolone poveča, poveča pa se tudi njen upor. Tako je za doseganje hitrosti pretoka eluenta 0,5–2,0 ml/min potreben tlak (1–3)·107Pa. Silikagel prenese tak padec tlaka, medtem ko so granule polimernega sorbenta bolj elastične in se deformirajo. V zadnjem času so bili razviti mehansko močni polimerni sorbenti z makroporozno strukturo z gosto mrežo, ki so po učinkovitosti blizu silikagelom. Oblika delcev sorbenta velikosti 10 µm in več nima velikega vpliva na učinkovitost kolone, prednost pa imajo sorbenti s sferično obliko, ki dajejo bolj prepustno polnilo (slika).
riž. Sferični silikagel
http://slike. /6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif
http:///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg
Notranja struktura delca silikagela je sistem komunikacijskih kanalov. Za tekočinsko kromatografijo se uporabljajo sorbenti s premerom por 6–25 nm. Ločevanje s tekočinsko kromatografijo poteka predvsem na silikagelih, modificiranih z reakcijo alkil - in arilklorosilanov ali alkiletoksisilanov s silanolnimi površinskimi skupinami. S pomočjo takšnih reakcij se cepijo skupine C8H17-, C18H37- ali C6H5- (za pridobitev sorbentov s hidrofobizirano površino), nitrilne, hidroksilne skupine itd. (Sl.)
https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg" width="166" height="116 src=">
riž. Struktura modificiranega silikagela
silikagelov uporabljajo v kromatografiji za ločevanje mešanic naftnih derivatov, viš maščobne kisline, njihovi estri, aromatski amini, nitro derivati organske spojine. silikagel – hidrofilni sorbent, zlahka zmoči z vodo. Zato ga ni mogoče uporabiti za sorpcijo iz vodnih raztopin. Aktivnost silikagela je odvisna od vsebnosti vode v njem: manj vode vsebuje, večja je aktivnost (Brockmannova lestvica).
Odvisnost aktivnosti silikagela od vsebnosti vlage
Specifična površina silikagelov je 500-600 m2/g.
aktivno oglje so oblika ogljika, ki med predelavo postane izredno porozna in ima zelo veliko površino, ki je na voljo za adsorpcijo ali kemične reakcije (slika) Imajo specifično površino 1300-1700 m2/g.
riž. Aktivno oglje
http://e-katalog. rusbiz. ru/user_images/ru/prod_picture/58035161249b9016f64372.jpg
Glavni vpliv na strukturo por aktivnega oglja imajo vhodne snovi za njihovo proizvodnjo. Za aktivno oglje na osnovi kokosovih lupin je značilen večji delež mikropor (do 2 nm), na osnovi oglja pa večji delež mezopor (2-50 nm). Velik delež makropor je značilen za aktivno oglje na osnovi lesa (več kot 50 nm). Mikropore so posebej primerne za adsorpcijo majhnih molekul, mezopore pa za adsorpcijo večjih organskih molekul.
Zeoliti (molekularna sita)– porozni kristalni aluminosilikati alkalijskih in zemeljskoalkalijskih kovin naravnega in sintetičnega izvora. (riž.)
https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg" width="211 height=211" height="211">
riž. Zeoliti
http://www. zeolit. spb. en/_img/_36mm. jpg
http://kntgroup. en/thumb. php? file=/uploads/products/6.jpg&x_width=250
Obstajajo štiri vrste zeolitov (A, X, Y, M) z različnimi kristalnimi strukturami. Glede na kation so zeoliti označeni takole: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Značilnost zeolitov je to pore kristalov imajo dimenzije reda 0,4-1 nm, sorazmerne z velikostjo molekul veliko tekočih ali plinastih snovi. Če molekule snovi lahko prodrejo v te pore, potem pride do adsorpcije v porah kristalov zeolita. Večje molekule snovi se ne adsorbirajo. Z izbiro zeolitov z različnimi velikostmi por lahko jasno ločimo mešanice različnih snovi.
Specifična površina zeolitov je 750-800 m2/g.
Pri izbiri adsorbenta je treba upoštevati strukturo snovi in njihovo topnost. Na primer, nasičeni ogljikovodiki se slabo adsorbirajo, medtem ko so nenasičeni ogljikovodiki (imajo dvojne vezi) boljši. Funkcionalne skupine povečajo sposobnost snovi za adsorpcijo.
5. Eluenti
Pri izbiri topila (eluenta) je treba upoštevati naravo adsorbenta in lastnosti snovi v mešanici, ki jo ločujemo. Eluenti morajo dobro raztopiti vse sestavine kromatografirane zmesi, imeti nizko viskoznost, zagotavljati zahtevano stopnjo selektivnosti, biti poceni, netoksični, inertni, združljivi z detekcijskimi metodami (npr. benzena ni mogoče uporabiti kot eluent z UV detektorjem).
Normalnofazna kromatografija običajno uporablja ogljikovodike (heksan, heptan, izooktan, cikloheksan) z dodatkom majhnih količin CHCl3 kloroforma, izo-C3H7OH izo-propanola, diizopropil etra; v reverzno fazni kromatografiji - zmes vode z acetonitrilom CH3CN, metanol CH3OH, etanol C2H5OH, dioksan, tetrahidrofuran, dimetilformamid. Za izolacijo posameznih komponent zmesi, ločenih med kromatografijo, jih pogosto izpiramo zaporedno (elucija). V ta namen se uporabljajo topila z različno desorpcijsko kapaciteto. Topila so v polarnih adsorbentih razvrščena v padajočem vrstnem redu glede na desorpcijsko zmogljivost - Trappejev eluotropni niz. Če imajo sestavine mešanice, ki se ločuje, blizu vrednosti k" ( kolonski kapacitetni koeficient glede na to komponento), nato kromatografirajte z enim eluentom. Če sorbent močno zadrži posamezne sestavine mešanice, uporabite serijo eluentov z naraščajočo močjo.
Eluotropno območje topil
6. Oprema za tekočinsko kromatografijo
V sodobni tekočinski kromatografiji se uporabljajo instrumenti različnih stopenj kompleksnosti - od najpreprostejših sistemov do vrhunskih kromatografov.
Sodobni tekočinski kromatograf vključuje: posode za eluente, visokotlačne črpalke, dozirnik, kromatografsko kolono, detektor, zapisovalno napravo, krmilni sistem in matematično obdelavo rezultatov.
Na sl. predstavljen je blokovni diagram tekočinskega kromatografa, ki vsebuje najmanjši potrebni nabor komponent, v takšni ali drugačni obliki, prisotnih v katerem koli kromatografskem sistemu.
https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg" width="361" height="254 src=">
riž. Shema tekočinskega kromatografa: 1 - rezervoar za mobilno fazo, 2 - črpalka, 3 - injektor, 4 - kolona, 5 - termostat, 6 - detektorji, 7 - zapisovalni sistem, 8 - računalnik.
Rezervoar za shranjevanje za mobilno fazo, mora imeti zadostno zmogljivost za analizo in naprava za razplinjevanje topil da se prepreči nastajanje mehurčkov plinov, raztopljenih v eluentu v koloni in detektorju.
Črpalka namenjeno ustvariti stalen pretok topila. Njegovo zasnovo določa predvsem delovni tlak v sistemu. Za delovanje v območju 10-500 MPa se uporabljajo črpalke tipa bata (brizge). Njihova pomanjkljivost je potreba po občasnih postankih za polnjenje z eluentom. Za preproste sisteme z nizkimi delovnimi tlaki 1-5 MPa se uporabljajo poceni peristaltične črpalke. Eluenti vstopijo v črpalko skozi filter, ki ujame prašne delce (večje od 0,2 µm). Včasih se skozi eluente spusti majhen tok helija, da se odstrani raztopljeni zrak in prepreči nastajanje mehurčkov v detektorju (zlasti v primeru vodnih in polarnih eluentov). Pri analitskih kromatografih se eluent v kolono dovaja z batnimi črpalkami s povratnim sistemom, ki omogočajo izravnavo pulziranja pretoka v območju 1–2 % in zagotavljajo volumetrične hitrosti od 0,1 do 25 ml/min pri tlakih do ~3,107. oče Pri mikrokolonski kromatografiji so volumetrične stopnje pretoka eluenta veliko nižje - 10-1000 µl/min. V primeru gradientne elucije se uporablja več črpalk, ki jih krmili programator in dovajajo 2-3 komponente eluenta v mešalno komoro, pri čemer skupni pretok ostane konstanten. Za vnos vzorca v kolono pod visokim pritiskom, brez zaustavitve pretoka, se uporabljajo posebni mikrodozirni ventili, povezani z zanko znane prostornine za vzorec preskusne raztopine. Razviti so bili dozirni sistemi s samodejnim vzorčenjem in vbrizgavanjem vzorcev z mikrodozirnimi pipami ali brizgami.
Injektor prispeva vbrizgavanje mešanega vzorca ločljivih komponent v kolono z dovolj visoko ponovljivostjo. Preprosti sistemi za vbrizgavanje vzorcev "stop-flow" zahtevajo zaustavitev črpalke in so zato manj priročni kot pipete z zanko Reodyne.
zvočniki za HPLC so najpogosteje izdelani iz polirane cevi iz nerjavnega jekla dolžine 10–25 cm in notranjega premera 3–5 mm.
riž. Kromatografske kolone za tekočinsko kromatografijo
Tudi rabljeno stekleni stebri nameščen v kovinskem ohišju; v mikrokolonski kromatografiji - tiskani kovinski stebri z notranjim premerom 1,0-1,5 mm, pakirane steklene mikrokolone s premerom 70-150 mikronov in votle kapilarne kolone premer 10-100 mikronov; v preparativni kromatografiji - kolone s premerom od 2 do 10 cm ali več. Za enakomerno in gosto polnjenje kolon s sorbentom se uporablja metoda pakiranja suspenzije. Suspenzijo pripravimo iz sorbenta in ustrezne organske tekočine, ki jo pod tlakom do 5 107 Pa dovajamo v kolono. Za določitev ločenih komponent, ki zapuščajo kolono uporaba detektorji. temperaturna konstantnost zagotovljeno termostat.
Detektorji za tekočinsko kromatografijo imajo pretočno celico, v kateri poteka neprekinjeno merjenje katere koli lastnosti tekočega eluenta. Morajo biti zelo občutljivi. Za povečanje občutljivosti detektorja se včasih uporablja derivatizacija komponent zmesi po koloni. Da bi to naredili, se s tokom eluenta uvajajo takšni reagenti, ki v interakciji z ločenimi snovmi tvorijo derivate z izrazitejšimi lastnostmi, na primer močneje absorbirajo v UV ali vidnem območju spektra ali imajo večjo fluorescentno sposobnost. . Včasih se derivatizacija izvede pred kromatografsko analizo in se ločijo derivati, ne pa izhodne snovi. Najbolj priljubljene vrste detektorji splošni namen so refraktometri, meriti lomni količnik, In spektrofotometrični detektorji definiranje optična gostota topila pri določeni valovni dolžini (običajno v ultravijoličnem območju). TO prednosti refraktometrov(In slabosti spektrofotometrov) je treba pripisati nizka občutljivost na vrsto povezave, ki lahko vsebuje ali ne vsebuje kromofornih skupin. Po drugi strani pa je uporaba refraktometrov omejena na izokratične sisteme (s konstantno sestavo eluenta), zato uporaba gradienta topila v tem primeru ni mogoča.
Diferencialni" href="/text/category/differentcial/" rel="bookmark">diferencialni ojačevalnik in snemalnik. Zaželeno je tudi imeti integrator, kar omogoča izračun relativnih površin nastalih vrhov. V kompleksnih kromatografskih sistemih, blok vmesnika, ki povezuje kromatograf z osebni računalnik, ki izvaja ne le zbiranje in obdelavo informacij, temveč tudi nadzoruje napravo, izračunava kvantitativne značilnosti in v nekaterih primerih kvalitativno sestavo mešanic. Mikroprocesor prispeva samodejno vbrizgavanje vzorca, spremeniti po podani program sestave eluenta z gradientno elucijo, vzdrževanje temperatura kolone.
Bruker". riž. tekočinski kromatograf Jasco
Vprašanja za samopregledovanje
Kaj je tekoča kromatografija? Poimenujte njegove vrste, področja uporabe. Seznam približno Osnovne kromatografske količine in njihova definicija Katere vrste tekočinske kromatografije obstajajo glede na mehanizem zadrževanja ločenih snovi s stacionarno fazo LC? Katere vrste kromatografije obstajajo glede na način gibanja snovi? Katere snovi se uporabljajo kot adsorbenti? Kakšna je razlika? Kaj je tekoča mobilna faza – eluent? zahteve po topilih. Kakšna je razlika med porazdelitveno kromatografijo in adsorpcijsko kromatografijo? Naštejte glavne dele vezja tekočinskega kromatografa, njihov namen.Seznam uporabljene literature
1 "Tekočinska kromatografija v medicini"
http://journal. issep. rssi. en/articles/pdf/0011_035.pdf
2 "Uvod v tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti"
http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html
3 "Tekočinska kromatografija"
http://e-znanost. en/index/?id=1540
4 "Kromatografija"
http://belchem. ljudi. en/kromatografija1.html
Kromatografsko ločevanje zmesi na koloni zaradi počasnega napredovanja PF traja dolgo časa. Za pospešitev postopka se kromatografija izvaja pod pritiskom. Ta metoda se imenuje visokozmogljiva tekočinska kromatografija (HPLC).
Posodobitev opreme, ki se uporablja pri klasični tekočinski kolonski kromatografiji, jo je uvrstila med obetavne in sodobne metode analize. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti je priročna metoda za ločevanje, preparativno izolacijo in izvajanje kvalitativne in kvantitativne analize nehlapnih, termolabilnih spojin z nizko in visoko molekulsko maso.
Odvisno od vrste sorbenta, ki se uporablja pri tej metodi, se uporabljata 2 različici kromatografije: na polarnem sorbentu z uporabo nepolarnega eluenta (možnost neposredne faze) in na nepolarnem sorbentu z uporabo polarnega eluenta - tako imenovana reverzna kromatografija. -fazna tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (RPHLC).
Ko eluent prehaja v eluent, se ravnotežje v pogojih RPHLC vzpostavi mnogokrat hitreje kot v pogojih polarnih sorbentov in nevodnih PF. Zaradi tega, kot tudi priročnosti dela z vodo in vodno-alkoholnimi eluenti, je RPHLC zdaj pridobil veliko popularnost. Večina analiz HPLC se izvaja s to metodo.
Instrumenti za HPLC
Kolone za HPLC so izdelane iz nerjavečega jekla z notranjim premerom 2-6 mm in dolžino 10-25 cm, napolnjene s sorbentom (NF). Kot NF se uporabljajo silikagel, aluminijev oksid ali modificirani sorbenti. Silikagel se običajno modificira s kemičnim vnosom različnih funkcionalnih skupin na njegovo površino.
Detektorji. Registracija izhoda iz stolpca ločene komponente se izvede z detektorjem. Za registracijo lahko uporabite spremembo katerega koli analitičnega signala, ki prihaja iz mobilne faze in je povezan z naravo in količino komponente mešanice. Tekočinska kromatografija uporablja takšne analitične signale, kot so absorpcija ali emisija svetlobe izstopajoče raztopine (fotometrični in fluorimetrični detektorji), lomni količnik (refraktometrični detektorji), potencial in električna prevodnost (elektrokemični detektorji) itd.
Nenehno zaznan signal snemalnik posname. Kromatogram je zaporedje detektorskih signalov, posnetih na snemalni trak, ki nastanejo, ko posamezne komponente zmesi zapustijo kolono. V primeru ločevanja zmesi so na zunanjem kromatogramu vidni ločeni vrhovi. Položaj vrha na kromatogramu se uporablja za identifikacijo snovi, višina ali površina vrha - za kvantitativno določitev.
Kvalitativna analiza
Najpomembnejše značilnosti kromatograma - retencijski čas t r in z njim povezan retenzijski volumen - odražajo naravo snovi, njihovo sposobnost sorpcije na materialu stacionarne faze in so zato pri stalnih pogojih kromatografije a sredstva za identifikacijo snovi. Za določeno kolono z določeno hitrostjo pretoka in temperaturo je retenzijski čas vsake spojine konstanten (slika - retenzijski čas internega standarda (snov v analizirani mešanici na začetku ni bila prisotna), h - višina vrha (mm), a 1 /2 - širina vrha na polovici višine, mm.
Za identifikacijo snovi s kromatogramom se običajno uporabljajo standardni vzorci ali čiste snovi. Retenzijski čas neznane komponente t Rx se primerja z retenzijskim časom t RCT znanih snovi. Zanesljivejša pa je identifikacija z merjenjem relativnega retencijskega časa
V tem primeru v kolono najprej vnesemo znano snov (interni standard) in izmerimo njen retenzijski čas t R(BC), nato kromatografsko ločimo (kromatografiramo) preskusno mešanico, ki ji predhodno dodamo interni standard.
Kvantitativna analiza
Ta analiza temelji na odvisnosti višine vrha h ali njegovega območja S od količine snovi. Za ozke vrhove je boljša meritev h, za široke zamegljene vrhove - S. Površino vrha merimo na različne načine: z množenjem višine vrha (h) z njegovo širino (a 1/2), merjeno na polovici njegove višine; načrtovanje; z uporabo integratorja. Sodobni kromatografi so opremljeni z električnimi ali elektronskimi integratorji.
Za določanje vsebnosti snovi v vzorcu se uporabljajo predvsem tri metode: metoda absolutne kalibracije, metoda interne normalizacije in metoda internega standarda.
Metoda absolutne kalibracije temelji na predhodni določitvi razmerja med količino vnesene snovi in površino oziroma višino vrha na kromatogramu. V kromatogram vnesemo znano količino umeritvene mešanice in določimo površine ali višine dobljenih vrhov. Zgradite graf površine ali višine vrha glede na količino vbrizgane snovi. Testni vzorec se analizira, izmeri se površina oziroma višina vrha komponente, ki jo določamo, in na podlagi umeritvene krivulje izračunamo njeno količino.
Metoda notranje normalizacije temelji na doseganju 100 % vsote površin vseh vrhov v kromatogramu.
Ta metoda daje informacije le o relativni vsebnosti komponente v mešanici, ne omogoča pa določitve njene absolutne vrednosti.
Metoda internega standarda temelji na primerjavi izbranega vrha parametra analita z enakim parametrom standardne snovi, vnesene v vzorec v znani količini. V preskusni vzorec vnesemo znano količino takšne standardne snovi, katere vrh je dovolj dobro ločen od vrhov komponent preskusne mešanice.
Zadnji dve metodi zahtevata uvedbo korekcijskih faktorjev, ki označujejo občutljivost uporabljenih detektorjev za analizirane snovi. Za različne tipe detektorjev in različne snovi se koeficient občutljivosti določi eksperimentalno.
Tekočinska adsorpcijska kromatografija uporablja tudi analizo frakcij raztopin, zbranih v trenutku, ko snov zapusti kolono. Analizo lahko izvajamo z različnimi fizikalno-kemijskimi metodami.
Tekočinska adsorpcijska kromatografija se uporablja predvsem za ločevanje organskih snovi. Ta metoda je zelo uspešna pri preučevanju sestave nafte, ogljikovodikov, učinkovito ločuje trans- in cis-izomere, alkaloide itd. S HPLC lahko določamo barvila, organske kisline, aminokisline, sladkorje, primesi pesticidov in herbicidov, zdravilne učinkovine. in drugih onesnaževalcev v živilskih izdelkih.
Oprema za tekočinsko kromatografijo.
V sodobni tekočinski kromatografiji se uporabljajo instrumenti različnih stopenj kompleksnosti - od najpreprostejših sistemov do vrhunskih kromatografov, opremljenih z različnimi dodatnimi napravami. Na sl. Slika 1 prikazuje blokovni diagram tekočinskega kromatografa, ki vsebuje najmanjši zahtevani nabor komponent, v takšni ali drugačni obliki, prisotnih v katerem koli kromatografskem sistemu.
riž. 1. Blok diagram tekočinskega kromatografa.
Črpalka (2) je zasnovana tako, da ustvarja stalen pretok topila. Njegovo zasnovo določa predvsem delovni tlak v sistemu. Za delovanje v območju 10-500 MPa se uporabljajo batne (brizgalne) ali batne črpalke. Pomanjkljivost prvega je potreba po občasnih postankih za polnjenje z eluentom, drugega pa velika zapletenost zasnove in posledično visoka cena. Za enostavne sisteme z nizkimi delovnimi tlaki 1-5 MPa se uspešno uporabljajo poceni peristaltične črpalke, a ker je težko doseči stalen tlak in pretok, je njihova uporaba omejena na pripravljalna opravila.
Injektor (3) poskrbi, da se vzorec zmesi ločenih komponent vbrizga v kolono z dovolj visoko ponovljivostjo. Preprosti sistemi za vbrizgavanje vzorcev "stop-flow" zahtevajo zaustavitev črpalke in so zato manj priročni kot pipete z zanko Reodyne.
Kolone HPLC (4) so cevi iz nerjavečega jekla z debelimi stenami, ki lahko prenesejo visok tlak. Pomembno vlogo igra gostota in enakomernost pakiranja kolone s sorbentom. Za nizkotlačno tekočinsko kromatografijo se uspešno uporabljajo steklene kolone z debelimi stenami. Konstantnost temperature zagotavlja termostat (5).
Detektorji (6) za tekočinsko kromatografijo imajo pretočno celico, v kateri se stalno merijo nekatere lastnosti tekočega eluenta. Najbolj priljubljene vrste detektorjev za splošno uporabo so refraktometri, ki merijo lomni količnik, in spektrofotometrični detektorji, ki merijo absorbanco topila pri določeni valovni dolžini (običajno v ultravijoličnem območju). Prednosti refraktometrov (in slabosti spektrofotometrov) vključujejo nizko občutljivost na vrsto določene spojine, ki morda ne vsebuje kromofornih skupin. Po drugi strani pa je uporaba refraktometrov omejena na izokratične sisteme (s konstantno sestavo eluenta), zato uporaba gradienta topila v tem primeru ni mogoča.
Snemalni sistem (7) je v najpreprostejšem primeru sestavljen iz diferencialnega ojačevalnika in snemalnika. Zaželeno je imeti tudi integrator, ki omogoča izračun relativnih površin nastalih vrhov. V kompleksnih kromatografskih sistemih se uporablja vmesniški blok, ki povezuje kromatograf z osebnim računalnikom (8), ki ne le zbira in obdeluje informacije, ampak tudi krmili instrument.
HPLC detektorji
Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) se uporablja za odkrivanje polarnih nehlapnih snovi, ki jih iz nekega razloga ni mogoče pretvoriti v obliko, primerno za plinsko kromatografijo, niti v obliki derivatov. Med takšne snovi sodijo zlasti sulfonske kisline, vodotopna barvila in nekateri pesticidi, kot so derivati fenilsečnine.
Detektorji:
Detektor z UV diodami. »Matrika« fotodiod (teh je več kot dvesto) konstantno registrira signale v UV in vidnem delu spektra ter tako zagotavlja snemanje UV-B spektrov v načinu skeniranja. To omogoča neprekinjeno snemanje, pri visoki občutljivosti, nepopačenih spektrov komponent, ki hitro prehajajo skozi posebno celico.
V primerjavi z detekcijo z eno valovno dolžino, ki ne zagotavlja informacij o "čistosti" vrha, zmožnost primerjave celotnega spektra niza diod zagotavlja rezultat identifikacije z veliko večjo stopnjo gotovosti.
Fluorescentni detektor. Velika priljubljenost fluorescenčnih detektorjev je posledica zelo visoke selektivnosti in občutljivosti ter dejstva, da številni onesnaževalci okolja fluorescirajo (na primer poliaromatski ogljikovodiki).
Elektrokemijski detektor se uporablja za zaznavanje snovi, ki se zlahka oksidirajo ali reducirajo: fenoli, merkaptani, amini, aromatski nitro in halogeni derivati, aldehidi, ketoni, benzidini.
Indikatorske cevi za testno določanje aromatskih aminov v zraku delovnega prostora
Aromatični amini imajo visoke toksične lastnosti in so značilne nizke največje dovoljene koncentracije v zraku. Nagnjenost k oksidativni razgradnji teh onesnaževal v okoljskih objektih omejuje možnost operativnega nadzora njihove vsebnosti na mestih lokalnih emisij. To določa ustreznost uporabe analitskih sistemov, ki temeljijo na testnih določitvah snovi za oceno kontaminacije različnih medijev. Preskusne metode, ki vključujejo analizne naprave z neposredno detekcijo analiznega signala brez dodatnega vzorčenja in vzorčenje analiziranih vzorcev, omogočajo najbolj ekonomično in objektivno pridobivanje informacij o stanju okolja.
Cilj dela je razviti indikatorske epruvete za testno določanje amino spojin v zraku na osnovi novega, obetavnega razreda reagentov za molekularno organsko analizo klorodinitro-substituiranega benz-2,1,3-oksadiazola in njihovih N-oksidov. .
Barva nastalih derivatov je odvisna od narave spojine, ki jo določamo, opazovani batokromni premik absorpcijskih pasov pa je določen s stopnjo substitucije amino skupine in prisotnostjo substituentov. To omogoča uporabo neposredne vizualne detekcije analitičnega signala kot osnove preskusne metode. Meje vizualne detekcije toksikantov dosegajo 0,05 mg/m 3 .
Razvite indikatorske cevi se uporabljajo kot učinkoviti kemisorpcijski vzorčevalniki (kemijski dozimetri) za analizo zraka, ki vsebuje mešanico amino spojin. Hitrost vzorčenja je bila eksperimentalno določena s stopnjo absorpcije toksičnih snovi v selektivni plasti. Sestavo in količino, na primer, substituiranih anilinov lahko določimo po eluiranju produktov kemisorpcije iz silikagela s HPLC. Hkrati širok nabor potencialnih komponent industrijskih ekosistemov ne vpliva na rezultate določitev.
Tekočinska adsorpcijska kromatografija na koloni
Ločevanje zmesi snovi v adsorpcijski koloni nastane kot posledica njihove razlike v vpijanju na danem adsorbentu (v skladu z zakonom o adsorpcijski substituciji, ki ga je določil M. S. Tsvet).
Adsorbenti so porozna telesa z visoko razvito notranjo površino, ki zadržujejo tekočine z medmolekulskimi in površinskimi pojavi. To so lahko polarne in nepolarne anorganske in organske spojine. Polarni adsorbenti vključujejo silikagel (posušen želatinast silicijev dioksid), aluminijev oksid, kalcijev karbonat, celulozo, škrob itd. Nepolarni sorbenti - aktivno oglje, gumijasti prah in mnogi drugi, pridobljeni sintetično.
Za adsorbente veljajo naslednje zahteve: S ne smejo vstopati v kemične reakcije z mobilno fazo in snovmi, ki jih je treba ločiti; S mora imeti mehansko trdnost; Zrna adsorbenta morajo biti enake stopnje razpršenosti.
Pri izbiri pogojev za kromatografski proces se upoštevajo lastnosti adsorbenta in adsorbiranih snovi.
Pri klasični različici tekočinske kolonske kromatografije (LCC) se eluent (PF) spusti skozi kromatografsko kolono, ki je steklena cev premera 0,5–5 cm in dolžine 20–100 cm, napolnjena s sorbentom (NF). Eluent se premika pod vplivom gravitacije. Hitrost njegovega gibanja je mogoče prilagoditi z žerjavom na dnu stebra. Mešanica za analizo se postavi na vrh kolone. Ko se vzorec premika skozi kolono, se komponente ločijo. V določenih intervalih se odvzamejo frakcije eluenta, sproščenega iz kolone, ki se analizirajo s katero koli metodo, ki omogoča merjenje koncentracij analitov.
Kolonska adsorpcijska kromatografija se trenutno uporablja predvsem ne kot samostojna metoda analize, temveč kot metoda predhodnega (včasih končnega) ločevanja kompleksnih zmesi v enostavnejše, tj. za pripravo na analizo z drugimi metodami (vključno s kromatografijo). Na primer, zmes tokoferolov ločimo na koloni aluminijevega oksida, prepustimo eluent in zberemo frakcijo α-tokoferola za naknadno fotometrično določanje.
Kromatografsko ločevanje zmesi na koloni zaradi počasnega napredovanja PF traja dolgo časa. Za pospešitev postopka se kromatografija izvaja pod pritiskom. Ta metoda se imenuje visokozmogljiva tekočinska kromatografija (HPLC).
Posodobitev opreme, ki se uporablja pri klasični tekočinski kolonski kromatografiji, jo je uvrstila med obetavne in sodobne metode analize. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti je priročna metoda za ločevanje, preparativno izolacijo in izvajanje kvalitativne in kvantitativne analize nehlapnih, termolabilnih spojin z nizko in visoko molekulsko maso.
Odvisno od vrste uporabljenega sorbenta ta metoda uporablja 2 možnosti kromatografije: na polarnem sorbentu z nepolarnim eluentom (možnost neposredne faze) in na nepolarnem sorbentu z uporabo polarnega eluenta - tako imenovani reverznofazni visoko - zmogljiva tekočinska kromatografija (RP HPLC).
Ko eluent prehaja v eluent, se ravnotežje v pogojih RPHLC vzpostavi mnogokrat hitreje kot v pogojih polarnih sorbentov in nevodnih PF. Zaradi tega, kot tudi priročnosti dela z vodo in vodno-alkoholnimi eluenti, je RPHLC zdaj pridobil veliko popularnost. Večina analiz HPLC se izvaja s to metodo.
Instrumenti za HPLC
Komplet sodobne opreme za HPLC je praviloma sestavljen iz dveh črpalk 3,4 (sl. 7.1.1.1), ki ju krmili mikroprocesor 5 in dovajata eluent po določenem programu. Črpalke ustvarjajo tlak do 40 MPa. Vzorec se vbrizga skozi posebno napravo (injektor) 7 neposredno v tok eluenta. Po prehodu skozi kromatografsko kolono 8 snovi zazna visoko občutljiv detektor pretoka 9, katerega signal posname in obdela mikroračunalnik 11. Po potrebi se frakcije samodejno izberejo v času največjega izhoda.
Kolone za HPLC so izdelane iz nerjavečega jekla z notranjim premerom 2 - 6 mm in dolžine 10-25 cm, napolnjene s sorbentom (NF). Kot NF se uporabljajo silikagel, aluminijev oksid ali modificirani sorbenti. Silikagel se običajno modificira s kemičnim vnosom različnih funkcionalnih skupin na njegovo površino.
Detektorji. Registracija izhoda iz stolpca ločene komponente se izvede z detektorjem. Za registracijo lahko uporabite spremembo katerega koli analitičnega signala, ki prihaja iz mobilne faze in je povezan z naravo in količino komponente mešanice. Tekočinska kromatografija uporablja takšne analitične signale, kot so absorpcija ali emisija svetlobe izstopajoče raztopine (fotometrični in fluorimetrični detektorji), lomni količnik (refraktometrični detektorji), potencial in električna prevodnost (elektrokemični detektorji) itd.
Nenehno zaznan signal snemalnik posname. Kromatogram je zaporedje detektorskih signalov, posnetih na snemalnik, ki nastanejo, ko posamezne komponente zmesi zapustijo kolono. V primeru ločevanja zmesi so na zunanjem kromatogramu vidni ločeni vrhovi. Položaj vrha na kromatogramu se uporablja za namene identifikacije snovi, višina ali površina vrha pa za namene kvantitativnega določanja.
Kvalitativna analiza
Najpomembnejše značilnosti kromatograma - retencijski čas tR in z njim povezan retenzijski volumen - odražajo naravo snovi, njihovo sposobnost sorpcije na materialu stacionarne faze in so zato pri stalnih pogojih kromatografije a sredstva za identifikacijo snovi. Za določeno kolono z določenim pretokom in temperaturo je retencijski čas posamezne spojine konstanten (slika 7.1.1.2), kjer je t.R(A) retencijski čas komponente A analizirane zmesi od trenutka, ko je vbrizgana v kolono, dokler se na izstopu iz kolone ne pojavi maksimalni vrh, 1K( ss) - retencijski čas internega standarda (snov, ki je v analizirani zmesi na začetku odsotna), h - višina vrha (mm), ab - širina vrha na polovici njegove višine, mm.
Za identifikacijo snovi s kromatogramom se običajno uporabljajo standardni vzorci ali čiste snovi. Primerjajte retenzijski čas neznane komponente IR* z retenzijskim časom IRCT znanih snovi. Zanesljivejša pa je identifikacija z merjenjem relativnega retencijskega časa
V tem primeru v kolono najprej vnesemo znano snov (interni standard) in izmerimo njen retenzijski čas tR(Bc), nato kromatografsko ločimo (kromatografiramo) testno mešanico, ki ji predhodno dodamo interni standard. Relativni retencijski čas je določen s formulo (7.1.1.1).
Kvantitativna analiza
Ta analiza temelji na odvisnosti višine vrha h ali njegovega območja S od količine snovi. Za ozke vrhove je boljša meritev h, za široke zamegljene vrhove - S. Površina vrha se meri na različne načine: z množenjem višine vrha (h) z njegovo širino (ai / 2), merjeno na polovici njegove višine (sl. 7.2.3); načrtovanje; z uporabo integratorja. Sodobni kromatografi so opremljeni z električnimi ali elektronskimi integratorji.
Za določanje vsebnosti snovi v vzorcu se uporabljajo predvsem tri metode: metoda absolutne kalibracije, metoda interne normalizacije in metoda internega standarda.
Metoda absolutne kalibracije temelji na predhodni določitvi razmerja med količino vnesene snovi in površino oziroma višino vrha na kromatogramu. V kromatogram vnesemo znano količino umeritvene mešanice in določimo površine ali višine dobljenih vrhov. Zgradite graf površine ali višine vrha glede na količino vbrizgane snovi. Testni vzorec se analizira, izmeri se površina oziroma višina vrha komponente, ki jo določamo, in na podlagi umeritvene krivulje izračunamo njeno količino.
Ta metoda daje informacije le o relativni vsebnosti komponente v mešanici, ne omogoča pa določitve njene absolutne vrednosti.
Metoda internega standarda temelji na primerjavi izbranega vrha parametra analita z enakim parametrom standardne snovi, vnesene v vzorec v znani količini. V preskusni vzorec se vnese znana količina takšne standardne snovi, katere vrh je dovolj dobro ločen od vrhov komponent preskusne mešanice.
Zadnji dve metodi zahtevata uvedbo korekcijskih faktorjev, ki označujejo občutljivost uporabljenih detektorjev za analizirane snovi. Za različne tipe detektorjev in različne snovi se koeficient občutljivosti določi eksperimentalno.
Tekočinska adsorpcijska kromatografija uporablja tudi analizo frakcij raztopin, zbranih v trenutku, ko snov zapusti kolono. Analizo lahko izvajamo z različnimi fizikalno-kemijskimi metodami.
Tekočinska adsorpcijska kromatografija se uporablja predvsem za ločevanje organskih snovi. Ta metoda je zelo uspešna pri preučevanju sestave nafte, ogljikovodikov, učinkovito ločuje trans- in cis-izomere, alkaloide itd. S HPLC lahko določamo barvila, organske kisline, aminokisline, sladkorje, primesi pesticidov in herbicidov, zdravilne učinkovine. in drugih onesnaževalcev v živilskih izdelkih.