Вэжх высокоэффективная жидкостная хроматография. Высокоэффективная жидкостная хроматография - High-performance liquid chromatography. Список использованной литературы

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) характер происходящих процессов в хроматографической колонке, в общем идентичен с процессами в газовой хроматографии. Отличие состоит лишь в применении в качестве неподвижной фазы жидкости. В связи с высокой плотностью жидких подвижных фаз и большим сопротивлением колонок газовая и жидкостная хроматография сильно различаются по аппаратурному оформлению.

В ВЭЖХ в качестве подвижных фаз обычно используют чистые растворители или их смеси.

Для создания потока чистого растворителя (или смесей растворителей), называемого в жидкостной хроматографии элюентом, используются насосы, входящие в гидравлическую систему хроматографа.

Адсорбционная хроматография осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия, как с растворителем, так и с адсорбентом.

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным объемом, поверхностью и диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и другие адсорбенты. Основная причина этого:

недостаточная механическая прочность, не позволяющая упаковывать и использовать при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ;

силикагель по сравнению с оксидом алюминия обладает более широким диапазоном пористости, поверхности и диаметра пор; значительно большая каталитическая активность оксида алюминия приводит к искажению результатов анализа вследствие разложения компонентов пробы либо их необратимой хемосорбции.

Детекторы для ВЭЖХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется для детектирования полярных нелетучих веществ, которые по каким-либо причинам не могут быть переведены в форму удобную для газовой хроматографии, даже в виде производных. К таким веществам, в частности, относят сульфоновые кислоты, водорастворимые красители и некоторые пестициды, например производные фенил - мочевины.

Детекторы:

УФ - детектор на диодной матрице. «Матрица» фотодиодов (их более двухсот) постоянно регистрирует сигналы в УФ- и видимой области спектра, обеспечивая таким образом запись УФ-В-спектров в режиме сканирования. Это позволяет непрерывно снимать при высокой чувствительности неискаженные спектры быстро проходящих через специальную ячейку компонентов.

По сравнению с детектированием на одной длине волны, которое не дает информации о «чистоте» пика, возможности сравнения полных спектров диодной матрицы обеспечивают получение результата идентификации с гораздо большей степенью достоверности.

Флуоресцентный детектор. Большая популярность флуоресцентных детекторов объясняется очень высокой селективностью и чувствительностью, и тем фактором, что многие загрязнители окружающей среды флуоресцируют (например, полиароматические углеводороды).

Электрохимический детектор используются для детектирования веществ, которые легко окисляются или восстанавливаются: фенолы, меркаптаны, амины, ароматические нитро- и галогенпроизводные, альдегиды кетоны, бензидины.

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медлен-ного продвижения ПФ занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют вы-сокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ)

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хроматографии, сделала ее одним из перспективных и совре-менных методов анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и про-ведения качественного и количественного анализа нелетучих термола-бильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют 2 варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемая обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОфВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбентов и неводных ПФ. Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хроматограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца по-следовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из ко-лонки отдельных компонентов смеси. В случае разделения смеси на внеш-ней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хроматограмме используют для целей идентификации вещества, высоту или площадь пика - для целей количественного определения.

(ОФС 42-0096-09)

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой (ПФ) служит жид-

кость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную непод-

вижной фазой (сорбентом). Колонки для ВЭЖХ характеризуются высоким гидравлическим давлением на входе в колонку, поэтому ВЭЖХ иногда назы-

вают «жидкостной хроматографией высокого давления».

В зависимости от механизма разделения веществ различают следую-

щие варианты ВЭЖХ: адсорбционную, распределительную, ионообменную,

эксклюзионную, хиральную и др.

В адсорбционной хроматографии разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с по-

верхности адсорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля.

В распределительной ВЭЖХ разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной

(как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и

подвижной фазами.

По полярности ПФ и НФ ВЭЖХ разделяют на нормально-фазовую и об-

ращенно-фазовую.

Нормально-фазовым называют вариант хроматографии, в котором ис-

пользуются полярный сорбент (например, силикагель или силикагель с при-

витыми NH2 - или CN-группами) и неполярная ПФ (например, гексан с раз-

личными добавками). В обращенно-фазовом варианте хроматографии ис-

пользуют неполярные химически модифицированные сорбенты (например,

неполярный алкильный радикал C18 ) и полярные подвижные фазы (например,

метанол, ацетонитрил).

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоции-

ровавшие в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через

сорбент (катионит или анионит) за счет их разной скорости обмена с ионны-

ми группами сорбента.

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной)

хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми из ко-

лонки выходят наиболее крупные молекулы (с наибольшей молекулярной массой), способные проникать в минимальное число пор неподвижной фазы,

а последними выходят вещества с малыми размерами м олекул.

Часто разделение протекает не по одному, а по нескольким механи змам одновременно.

Метод ВЭЖХ может применяться для контроля качества любых нега-

зообразных анализируемых веществ. Для проведения анализа используют соответствующие приборы – жидкостные хроматографы.

В состав жидкостного хроматографа обычно входят следующие основ-

ные узлы:

– узел подготовки ПФ, включая емкость с подвижной фазой (или емко-

сти с отдельными растворителями, входящими в состав подвижной фа-

зы) и систему дегазации ПФ;

– насосная система;

– смеситель подвижной фазы (при необходимости);

– система ввода пробы (инжектор);

– хроматографическая колонка (может быть установлена в термостате);

– детектор;

– система сбора и обработки данных.

Насосная система

Насосы обеспечивают подачу ПФ в колонку с заданной постоянной скоростью. Состав подвижной фазы может быть постоянным или меняю-

щимся во время анализа. В первом случае процесс называют изократическим,

а во втором – градиентным. Перед насосной системой иногда устанавливают

фильтры с диаметром пор 0,45 мкм для фильтрации подвижной фазы. Совре-

менная насосная система жидкостного хроматографа состоит из одного или нескольких насосов, управляемых компьютером. Это позволяет менять со-

став ПФ по определенной программе при градиентном элюировании. Сме-

шение компонентов ПФ в смесителе может происходить как при низком дав-

лении (до насосов), так и при высоком давлении (после насосов). Смеситель можно использовать для подготовки ПФ и при изократическом элюировании,

однако более точное соотношение компонентов достигается при предвари-

тельном смешении компонентов ПФ для изократического процесса. Насосы для аналитической ВЭЖХ позволяют поддерживать постоянную скорость подачи ПФ в колонку в интервале от 0,1 до 10 мл/мин при давлении на входе в колонку до 50 МПа. Целесообразно, однако, чтобы это значение не превы-

шало 20 МПа. Пульсации давления минимизируются специальными демп-

ферными системами, входящими в конструкцию насосов. Рабочие детали на-

сосов изготавливаются из коррозионностойких материалов, что позволяет использовать в составе ПФ агрессивные компоненты.

Смесители

По своей конструкции смесители могут быть статическими или дина-

мическими.

В смесителе происходит образование единой подвижной фазы из от-

дельных растворителей, подаваемых насосами, если необходимая смесь не была приготовлена заранее. Смешивание растворителей обычно происходит самопроизвольно, но иногда применяются системы с принудительным сме-

шиванием.

Инжекторы

Инжекторы могут быть универсальными для ввода проб от

1 мкл до 2 мл или дискретными для ввода пробы только определенного объ-

ема. Оба типа инжекторов могут быть автоматическими («автоинжекторы» или «автосэмплеры»). Инжектор для ввода пробы (раствора) расположен не-

посредственно перед хроматографической колонкой. Конструкция инжектора позволяет изменять направление потока ПФ и осуществлять предварительное введение пробы в петлю определенного объема (обычно от 10 до 100 мкл).

Этот объем указан на маркировке петли. Конструкция инжектора позволяет осуществлять замену петли. Для введения анализируемого раствора в неав-

томатический инжектор используется ручной микрошприц с объемом, значи-

тельно превосходящим объем петли. Избыток введенного раствора, не по-

местившийся в петле, сбрасывается, и в колонку вводится точный и всегда одинаковый объем пробы. Ручное неполное заполнение петли снижает точ-

ность и воспроизводимость дозирования и, следовательно, ухудшает точ-

ность и воспроизводимость хроматографического анализа.

Хроматографическая колонка

Хроматографические колонки обычно представляют собой трубки из нержавеющей стали, стекла или пластика, заполненные сорбентом и закры-

тые с обеих сторон фильтрами с диаметром пор 2–5 мкм. Длина аналитиче-

ской колонки в зависимости от механизма хроматографического разделения может находиться в диапазоне от 5 до 60 см и более (обычно она составляет

10–25 см), внутренний диаметр – от 2 до 10 мм (обычно 4,6 мм). Колонки с внутренним диаметром менее 2 мм используются в микроколоночной хрома-

тографии. Используются также капиллярные колонки с внутренним диамет-

ром около 0,3-0,7 мм. Колонки для препаративной хроматографии имеют внутренний диаметр до 50 мм и более.

Перед аналитической колонкой могут устанавливаться короткие ко-

лонки (предколонки) выполняющие различные вспомогательные функции

(чаще – защита аналитической колонки). Обычно анализ проводят при ком-

натной температуре, однако для увеличения эффективности разделения и со-

кращения продолжительности анализа может быть использовано термоста-

тирование колонок при температурах не выше 60 С. При более высоких температурах возможна деструкция сорбента и изменение состава ПФ.

Неподвижная фаза (сорбент)

В качестве сорбентов обычно применяются:

1. Силикагель, оксид алюминия, пористый графит используются в нор-

мально-фазовой хроматографии. Механизм удерживания в данном слу-

чае – обычно адсорбция;

2. Смолы или полимеры с кислотными или основными группами. Область применения – ионообменная хроматография;

3. Пористый силикагель или полимеры (эксклюзионная хроматография);

4. Химически модифицированные сорбенты (сорбенты с привитыми фа-

зами), приготовленные чаще всего на основе силикагеля. Механизм удерживания в большинстве случаев – распределение между подвиж-

ной и неподвижной фазами;

5. Химически модифицированные хиральные сорбенты, например произ-

водные целлюлозы и амилозы, протеины и пептиды, циклодекстрины,

используемые для разделения энантиомеров (хиральная хроматогра-

Сорбенты с привитыми фазами могут иметь различную степень хими-

ческой модификации. Частицы сорбента могут иметь сферическую или не-

правильную форму и разнообразную пористость.

В качестве привитых фаз наиболее часто применяются:

– октильные группы (сорбент октилсилан или С8 );

– октадецильные группы (сорбент октадецилсилан

(ODS) или С18 );

– фенильные группы (сорбент фенилсилан);

– цианопропильные группы (сорбент CN);

– аминопропильные группы (сорбент NH2 );

– диольные группы (сорбент диол).

Наиболее часто анализ выполняют на неполярных привитых фазах в

обращенно-фазовом режиме с применением сорбента С18 .

В некоторых случаях более целесообразно применять нормально-

фазовую хроматографию. При этом используют силикагель или полярные привитые фазы («CN», «NH2 », «диол») в сочетании с неполярными раствори-

Сорбенты с привитыми фазами химически устойчивы при значениях pH от 2,0 до 8,0, если другое специально не оговаривается производителем.

Частицы сорбента могут иметь сферическую или неправильную форму и разнообразную пористость. Размер частиц сорбента в аналитической ВЭЖХ обычно составляет 3–10 мкм, в препаративной ВЭЖХ – до 50 мкм и более.

Используются также монолитные сорбенты.

Высокая эффективность разделения обеспечивается высокой площадью поверхности частиц сорбента (которая является следствием их микроскопи-

ческих размеров и наличия пор), а также равномерностью состава сорбента и плотной и равномерной его упаковкой.

Детекторы

Используются различные способы детектирования. В общем случае ПФ с растворенными в ней компонентами после хроматографической колон-

ки попадает в ячейку детектора, где непрерывно измеряется то или иное ее свойство (поглощение в УФ или видимой области спектра, флуоресценция,

показатель преломления, электропроводность и др.). Полученная при этом хроматограмма представляет собой график зависимости некоторого физиче-

ского или физико-химического параметра ПФ от времени.

Наиболее распространенными являются спектрофотометрические де-

текторы (включая диодно-матричные), регистрирующие изменение оптиче-

ской плотности в ультрафиолетовой, видимой и часто в ближней инфракрас-

ной областях спектра от 190 до 800 или 900 нм. Хроматограмма в этом слу-

чае представляет собой зависимость оптической плотности ПФ от времени.

Традиционно используемый спектрофотометрический детектор позво-

ляет проводить детектирование при любой длине волны в его рабочем диапа-

зоне. Применяются также мультиволновые детекторы, позволяющие прово-

дить детектирование при нескольких длинах волн одновременно.

С помощью диодно-матричного детектора можно не только проводить детектирование сразу по нескольким длинам волн, но и практически мгно-

венно (без сканирования) получать оптический спектр ПФ в любой момент времени, что значительно упрощает качественный анализ разделяемых ком-

понентов.

Чувствительность флуоресцентных детекторов примерно в 1000 раз выше чувствительности спектрофотометрических. При этом используется либо собственная флуоресценция, либо флуоресценция соответствующих производных, если само определяемое вещество не флуоресцирует. Совре-

менные флуоресцентные детекторы позволяют не только получать хромато-

граммы, но и регистрировать спектры возбуждения и флуоресценции анали-

зируемых соединений.

Для анализа образцов, не поглощающих в УФ и видимой областях спектра (например, углеводов), используют рефрактометрические детекторы

(рефрактометры). Недостатки этих детекторов – их низкая (по сравнению со спектрофотометрическими детекторами) чувствительность и значительная температурная зависимость интенсивности сигнала (детектор необходимо термостатировать).

Используются также электрохимические детекторы (кондуктометриче-

ские, амперометрические и др.), масс-спектрометрические и Фурье-ИК-

детекторы, детекторы светорассеивания, радиоактивности и некоторые дру-

Подвижная фаза

В качестве ПФ могут применяться разнообразные растворители – как индивидуальные, так и их смеси.

В нормально-фазовой хроматографии обычно применяются жидкие уг-

леводороды (гексан, циклогексан, гептан) и другие относительно неполярные

растворители с небольшими добавками полярных органических соединений,

которые регулируют элюирующую силу ПФ.

В обращено-фазовой хроматографии в состав ПФ входят полярные ор-

ганические растворители (обычно ацетонитрил и метанол) и вода. Для опти-

мизации разделения часто используют водные растворы с определенным зна-

чением рН, в частности буферные растворы. Применяют добавки неоргани-

ческих и органических кислот, оснований и солей и другие соединения (на-

пример, хиральные модификаторы для разделения энантиомеров на ахираль-

ном сорбенте).

Контроль значения рН необходимо осуществлять отдельно для водного компоненента, а не для его смеси с органическим растворителем.

ПФ может состоять из одного растворителя, часто из двух, при необхо-

димости – из трех и более. Состав ПФ указывают как объемное соотношение входящих в нее растворителей. В отдельных случаях может указываться мас-

совое соотношение, что должно быть специально оговорено.

При использовании УФ-спектрофотометрического детектора ПФ не должна иметь выраженного поглощения при выбранной для детектирования длине волны. Предел прозрачности или оптическая плотность при опреде-

ленной длине волны растворителя конкретного изготовителя часто указыва-

ется на упаковке.

На хроматографический анализ большое влияние оказывает степень чистоты ПФ, поэтому предпочтительно применять растворители, выпущен-

ные специально для жидкостной хроматографии (включая воду).

ПФ и анализируемые растворы не должны содержать нерастворивших-

ся частиц и пузырьков газа. Воду, полученную в лабораторных условиях,

водные растворы, предварительно смешанные с водой органические раство-

рители, а также анализируемые растворы необходимо подвергать тонкой фильтрации и дегазации. Для этих целей обычно применяют фильтрование

под вакуумом через инертный по отношению к данному растворителю или раствору мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Система сбора и обработки данных

Современная система обработки данных представляет собой сопря-

женный с хроматографом персональный компьютер с установленным про-

граммным обеспечением, позволяющим регистрировать и обрабатывать хро-

матограмму, а также управлять работой хроматографа и следить за основны-

ми параметрами хроматографической системы.

Перечень условий хроматографирования, подлежащих указанию

В частной фармакопейной статье должны быть приведены размеры ко-

лонки, тип сорбента с указанием размера частиц, температура колонки (если необходимо термостатирование), объем вводимой пробы (объем петли), со-

став ПФ и способ ее приготовления, скорость подачи ПФ, детектор и усл овия детектирования, описание градиентного режима (если используется), время хроматографирования.

ИОНООБМЕННАЯ И ИОННАЯ ВЭЖХ

Ионообменная хроматография используется для анализа как органиче-

ских (гетероциклические основания, аминокислоты, белки и др.), так и неор-

ганических (различные катионы и анионы) соединений. Разделение компо-

нентов анализируемой смеси в ионообменной хроматографии основано на обратимом взаимодействии ионов анализируемых веществ с ионными груп-

пами сорбента. В качестве сорбентов используются аниониты или катиони-

ты. Эти сорбенты представляют собой, в основном, либо полимерные ионо-

обменные смолы (обычно сополимеры стирола и дивинилбензола с приви-

тыми ионными группами), либо силикагели с привитыми ионообменными группами. Сорбенты с группами -(СН2 )3 N+ Х– используются для разделения анионов, а сорбенты с группами -(СН2 )SО3 – Н+ – для разделения катионов.

Обычно для разделения анионов применяют полимерные смолы, а для разд е-

ления катионов – модифицированные силикагели.

В качестве ПФ в ионообменной хроматографии применяют водные растворы кислот, оснований и солей. Обычно используются буферные рас-

творы, позволяющие поддерживать определенные значения рН. Возможно также использование небольших добавок смешивающихся с водой органиче-

ских растворителей – ацетонитрила, метанола, этанола, тетрагидрофурана.

Ионная хроматография - вариант ионообменной хроматографии, в

котором для определения концентрации ионов анализируемого вещества ис-

пользуется кондуктометрический детектор. Для высокочувствительного оп-

ределения изменений электропроводности проходящей через детектор ПФ фоновая электропроводность ПФ должна быть низкой.

Существуют два основных варианта ионной хроматографии.

Первый из них основан на подавлении электропроводности электроли-

та ПФ с помощью второй ионообменной колонки, находящейся между ана-

литической колонкой и детектором. В этой колонке происходит нейтрализа-

ция ПФ и анализируемые соединения попадают в ячейку детектора в деиони-

зированной воде. Детектируемые ионы являются единственными ионами,

обеспечивающими проводимость ПФ. Недостаток подавляющей колонки – необходимость ее регенерации через достаточно короткие промежутки вре-

мени. Подавляющая колонка может быть заменена непрерывно действую-

щим мембранным подавителем, в котором состав мембраны непрерывно об-

новляется потоком регенерирующего раствора, движущегося в направлении,

противоположном направлению потока ПФ.

Второй вариант ионной хроматографии – одноколоночная ионная хро-

матография. В этом варианте используется ПФ с очень низкой электропро-

водностью. В качестве электролитов широко применяют слабые органиче-

ские кислоты – бензойную, салициловую или изофталевую.

ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ВЭЖХ

Эксклюзионная хроматография (гель-хроматография) – особый вариант ВЭЖХ, основанный на разделении молекул по их размерам. Распределение

молекул между неподвижной и подвижной фазами основано на размерах мо-

лекул и частично на их форме и полярности. Для разделения используют по-

ристые сорбенты – полимеры, силикагель, пористые стекла и полисахариды.

Размер частиц сорбентов 5–10 мкм.

Преимуществами пористых стекол и силикагеля являются быстрая диффузия ПФ и молекул анализируемого вещества в поры, устойчивость в различных условиях (даже при высоких температурах). Полимерные сорбен-

ты представляют собой сополимеры стирола и дивинилбензола (это гидро-

фобные сорбенты, используемые с неполярными подвижными фазами) и

гидрофильные гели, получаемые из сульфированного дивинилбензола или полиакриламидных смол.

Возможны два предельных типа взаимодействия молекул с пористой неподвижной фазой. Молекулы, размер которых больше среднего диаметр а пор, вообще не проникают в сорбент и элюируются вместе с подвижной фа-

зой первыми. Молекулы с диаметром значительно меньше размера пор сор-

бента свободно проникают в него, остаются в неподвижной фазе наибольшее время и элюируются последними. Молекулы средних размеров проникают в поры сорбента в зависимости от размера и частично в зависимости от своей формы. Они элюируются с различными временами удерживания между са-

мыми крупными и самыми мелкими молекулами. Разделение компонентов хроматографируемого образца происходит в результате повторяющихся ак-

тов диффузии компонентов образца в поры сорбента, и обратно.

В эксклюзионной хроматографии для характеристики удерживания ис-

пользуется объем удерживания, равный произведению скорости потока ПФ на время удерживания.

Подвижная фаза. Выбор ПФ зависит от типа сорбента. Эксклюзион-

ная хроматография в целом делится на гель-фильтрационную и гель-

проникающую хроматографию.

Метод гель-фильтрационной хроматографии используют для разделе-

ния водорастворимых соединений на гидрофильных сорбентах. Подвижные фазы представляют собой водные буферные растворы с заданным значением рН.

В гель-проникающей хроматографии применяются гидрофобные сор-

бенты и неполярные органические растворители (толуол, дихлорметан, тет-

рагидрофуран). Этот метод используют для анализа соединений, малораство-

римых в воде.

Детекторы. В качестве детекторов в эксклюзионной хроматографии используются дифференциальные рефрактометрические детекторы, а также спектрофотометрические детекторы (в том числе, в ИК-области спектра).

Применяются также вискозиметрический и проточный лазерный детекторы.

Эти детекторы в комбинации с рефрактометром или другим концентрацион-

ным детектором позволяют непрерывно определять молекулярную массу по-

лимера в ПФ.

УЛЬТРАЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Ультраэффективная жидкостная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, отличающийся большей эффективно-

стью по сравнению с классической ВЭЖХ.

Особенностью ультраэффективной жидкостной хроматографии являет-

ся использование сорбентов с размером частиц от 1,5 до 2 мкм. Размеры хро-

матографических колонок обычно составляют от 50 до 150 мм в длину и от 1

до 4 мм в диаметре. Объем вводимой пробы может составлять от 1 до 50 мкл.

Хроматографическое оборудование, используемое в классическом ва-

рианте ВЭЖХ, обычно специально адаптировано для этого вида хроматогра-

Оборудование, предназначенное для ультраэффективной жидкостной хроматографии, может использоваться и в классическом варианте ВЭЖХ.

Жидкостная хроматография

Жидкостная хроматография - это вид хроматографии, в котором подвижной фазой , называемой элюентом, является жидкость . Неподвижной фазой может быть твердый сорбент , твердый носитель с нанесенной на его поверхность жидкостью или гель .

Различают колоночную и тонкослойную жидкостную хроматографию. В колоночном варианте через колонку, заполненную неподвижной фазой, пропускают порцию разделяемой смеси веществ в потоке элюента, который движется под давлением или под действием силы тяжести. В тонкослойной хроматографии элюент перемещается под действием капиллярных сил по плоскому слою сорбента, нанесенного на стеклянную пластинку или металлическую фольгу, вдоль пористой полимерной пленки или по полоске специальной хроматографической бумаги. Разработан также метод тонкослойной жидкостной хроматографии под давлением, когда элюент прокачивают через слой сорбента, зажатого между пластинами.

Существуют такие виды жидкостной хроматографии, как аналитическая (для анализа смесей веществ) и препаративная (для выделения чистых компонентов).

Различают жидкостную хроматографию (ЖХ) в ее классическом варианте, проводимую при атмосферном давлении , и высокоскоростную ), осуществляемую при повышенном давлении . В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используют колонки диаметром до 5 мм, плотно упакованные сорбентом с частицами малого размера (3-10 мкм). Для прокачивания элюента через колонку применяют давление до 3.107 Па. Такой вид хроматографии называют хроматографией высокого давления . Пропускание элюента через колонку под высоким давлением позволяет резко увеличить скорость анализа и существенно повысить эффективность разделения за счет использования мелкодисперсного сорбента.

Вариантами ВЭЖХ являются микроколоночная хроматография на наполненных сорбентом колонках малого диаметра и капиллярная хроматография на полых и наполненных сорбентом капиллярных колонках. Метод ВЭЖХ в настоящее время позволяет выделять, количественно и качественно анализировать сложные смеси органических соединений.

Жидкостная хроматография - это важнейший физико-химический метод исследования в химии, биологии, биохимии , медицине, биотехнологии. Ее используют для:

· изучения процессов метаболизма в живых организмах лекарственных препаратов;

· диагностики в медицине;

· анализа продуктов химического и нефтехимического синтеза, полупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефти, сточных вод;

· изучения изотерм сорбции из раствора, кинетики и селективности химических процессов;

· выделения

· анализа и разделения смесей, их очистки и выделения из них многих биологических веществ, таких как аминокислоты, белки, ферменты, вирусы , нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, гормоны.

В химии высокомолекулярных соединений и в производстве полимеров с помощью жидкостной хроматографии анализируют качество мономеров, изучают молекулярно-массовое распределение и распределение по типам функциональности олигомеров и полимеров, что необходимо для контроля продукции.

Жидкостную хроматографию используют также в парфюмерии, пищевой промышленности , для анализа загрязнений окружающей среды , в криминалистике.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) был разработан и внедрен в середине 70-х годов XX века. Тогда появились первые жидкостные хроматографы.

Жидкостная хроматография является оптимальным методом анализа химически и термически нестойких молекул, высокомолекулярных веществ с пониженной летучестью. Это можно объяснить особой ролью подвижной фазы в ЖХ в отличие от газовой хроматографии: элюент выполняет не только транспортную функцию.

2. Основные понятия и классификация методов жидкостной хроматографии.

По механизму удерживания разделяемых веществ неподвижной фазой ЖХ различают:

осадочную хроматографию , основанную на различной растворимости осадков, которые образуются при взаимодействии компонентов анализируемой смеси с осадителем. Преимуществом метода является то, что получающиеся вдоль сорбента зоны имеют резкие границы, содержат осадки только одного вещества и часто разделены зонами чистого сорбента. Однако этот метод пока не нашел широкого распространения.

· адсорбционную хроматографию, в которой разделение осуществляется в результате взаимодействия разделяемого вещества с адсорбентом , таким как, оксид алюминия или силикагель, имеющим на поверхности активные полярные центры . Растворитель (элюент) - неполярная жидкость .

Рис. Схема разделения смеси веществ методом адсорбционной хроматографии

http://www. xumuk. ru/biologhim/bio/img014.jpg

Механизм сорбции состоит в специфическом взаимодействии между полярной поверхностью сорбента и полярными (либо способными поляризоваться) участками молекул анализируемого компонента (рис.). Взаимодействие происходит за счет донорно-акцепторного взаимодействия или образования водородных связей.

Рис. Схема адсорбционной жидкостной хроматографии

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg" width="219" height="200">

Рис. . Распределительная хроматография с привитой фазой (нормально-фазный вариант).

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

При нормально-фазном варианте распределительной жидкостной хроматографии в качестве модификаторов поверхности силикагеля (привитых фаз) используют замещенные алкилхлорсиланы, содержащие полярные группы, такие как нитрильная, аминогруппа и т. д. (рис.). Применение привитых фаз позволяет тонко управлять сорбционными свойствами поверхности неподвижной фазы и добиваться высокой эффективности разделения.

Обращённо-фазовая жидкостная хроматография основана на распределении компонентов смеси между полярным элюентом и неполярными группами (длинными алкильными цепочками), привитыми к поверхности сорбента (рис.). Реже используют вариант жидкостной хроматографии с нанесенными фазами, когда жидкая неподвижная фаза наносится на неподвижный носитель.

Рис. . Распределительная хроматография с привитой фазой (обращенно-фазный вариант). http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

К распределительной жидкостной хроматографии относится и экстракционная жидкостная хроматография , в которой неподвижной фазой служит органический экстрагент, нанесенный на твердый носитель, а подвижной - водный раствор разделяемых соединений. В качестве экстрагентов используют, например, фенолы, триалкилфосфаты, амины, четвертичные аммониевые основания, а также серосодержащие фосфорорганические соединения. Экстракционная жидкостная хроматография применяется для разделения и концентрирования неорганических соединений, например, ионов щелочных металлов, актиноидов и др. близких по свойствам элементов, в процессах переработки отработанного ядерного горючего.

ионообменную хроматографию, которая основана на обратимом стехиометрическом обмене ионов, содержащихся в анализируемом растворе, на подвижные ионы, входящие в состав ионитов. В зависимости от знака заряда ионизирующих групп иониты подразделяют на катиониты и аниониты. Существуют также амфотерные иониты – амфолиты , которые могут одновременно обменивать как катионы, так и анионы. Ионообменная хроматография применяется только для разделения заряженных частиц. В основе разделения лежит способность ионообменной смолы удерживать разные ионы с разной силой. Ионит состоит из полимерной матрицы и связанных с ней активных групп, которые способны к обмену ионов. Катионит обладает кислыми или слабокислыми свойствами, так как в его состав входят группы: - SO3H, –CH2SO3H, - COOH, - PO3H2 и другие, в которых подвижными являются ионы водорода. Аниониты обладают основными или слабоосновными свойствами и содержат группы: = NH2, - NH2, –NR3+,-OH и другие. Разделение ионов регулируют подбором оптимальных значений рН элюента и его ионной силы. Схематично ионный обмен можно представить реакциями:

R-H + Na+ + Cl - → R-Na + H+ + Cl - (катионный обмен)

R-OH + Na+ + Сl - → R-Сl + Na+ + OH - (анионный обмен)

Иониты должны удовлетворять следующим требованиям: быть химически устойчивыми в различных средах, механически прочными в сухом и особенно в набухшем состоянии, обладать большой поглотительной способностью и способностью хорошо регенерироваться.

В ионообменной (ионной) хроматографии, разделенные анионы (катионы) детектируют в виде кислот (соответствующих оснований) высокочувствительным кондуктометрическим детектором, где высокоэффективные колонки наполнены поверхностно-активным ионитом с небольшой емкостью.

ион-парную хроматографию , которую можно рассматривать как комбинацию адсорбционной и ионообменной хроматографии. В основу метода положена экстракция ионных веществ – перенос их из водной фазы в органическую фазу в виде ионных пар. Для этого в подвижную фазу добавляют противоион, который способен избирательно реагировать с анализируемыми компонентами, превращая их в комплексные соединения с образованием ионной пары. Основные преимущества такого варианта заключаются в том, что одновременно могут быть проанализированы вещества кислотного, основного и нейтрального характера.

лигандообменную хроматографию , основанную на различной способности разделяемых соединений образовывать комплексы с катионами переходных металлов – Cu+2, Ni+2, Zn+2, Cd+2, Co+2 и др. - и фиксирующими группами (лигандами) неподвижной фазы. Часть координационной сферы ионов металла занята молекулами воды или другими слабыми лигандами, которые могут вытесняться молекулами разделяемых соединений. Такой вид хроматографии используют для разделения оптических изомеров.

эксклюзионную хроматографию (ситовую, гель-проникающую, гель-фильтрационную), в которой разделение основано на различиях в размерах молекул .

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg" align="right" width="429" height="319">

Рис. Схема проведения гель-проникающей хроматографии

аффинную хроматографию (биоспецифическую), основанную на том, что многие биологически активные макромолекулы, например, ферменты могут специфически связываться с определённым реагентом. Реагент закрепляется на носителе (часто агарозе), затем промывается анализируемой смесью. На полимере задерживается только нужная макромолекула (рис.).

Рис. Схема аффинной хроматографии

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

Затем её удаляют с полимера, пропусканием раствора соединения, обладающего ещё большим сродством к макромолекуле. Особенно эффективна такая хроматография в биотехнологии и биомедицине для выделения ферментов, белков, гормонов.

В зависимости от способа перемещения вещества различают следующие варианты жидкостной хроматографии: проявительный, фронтальный и вытеснительный.
Чаще всего используют проявительный вариант, при котором в колонку в потоке элюента вводят порцию разделяемой смеси. Выход компонентов смеси из колонки регистрируется на хроматограмме в виде пиков. (рис.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg" width="291" height="165">

Рис. Схема проявительного варианта хроматографии

Высота или площадь пиков характеризует концентрацию компонентов , а удерживаемые объемы – качественный состав смеси . Идентификацию компонентов обычно проводят по совпадению времен удерживания со стандартными веществами, также используют химические или физико-химические методы.

При фронтальном варианте (рис.) через колонку непрерывно пропускают смесь разделяемых веществ, которая играет роль подвижной фазы. В итоге можно получить в чистом виде только вещество, которое менее всего сорбируется в колонке.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg" width="279" height="145">

Рис. Схема фронтального варианта хроматографии

Хроматограмма в этом случае представляет собой ступени, высоты которых пропорциональны концентрациям компонентов; удерживаемые объемы определяют по времени удерживания компонентов. При дифференцировании такой хроматограммы получают картину, аналогичную той, которую получают в проявительном варианте.

В вытеснительном варианте компоненты смеси, введенной в колонку, вытесняются элюентом, который адсорбируется сильнее любого компонента. В итоге получают примыкающие друг к другу фракции разделяемых веществ Порядок выхода компонентов определяется силой взаимодействия их с поверхностью сорбента (рис.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg" width="320" height="175">

Рис. Схема вытеснительного варианта хроматографии

3. Основные хроматографические величины и их определение.

При разделении веществ с помощью жидкостной хроматографии могут быть использованы, как указано выше, проявительный, фронтальный и вытеснительный варианты. Чаще всего используют проявительный вариант, при котором в колонку в потоке элюента вводят порцию разделяемой смеси. Выход компонентов смеси из колонки регистрируется на хроматограмме в виде пиков. Из хроматограммы (рис.) определяют:

времена удерживания несорбирующегося (t0), разделенных компонентов (tR1 , tR2, tR3 и т. д.) ; ширину оснований пиков (tw1, tw2 и т. д.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif" width="61" height="24 src=">;

b) исправленный удерживаемый объем компонента ,

где t"R - исправленное время удерживания компонента;

c) коэффициент емкости колонки по отношению к данному компоненту ;

d) эффективность колонки характеризуется числом эквивалентных теоретических тарелок

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif" width="129" height="51 src=">;

f) разрешение https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif" width="203 height=51" height="51">

Коэффициент емкости k" оказывает существенное влияние на величину R S: при изменении k " от 0 до 10 (оптимальные пределы) R S сильно возрастает. Значение k" определяется удвоенной поверхностью сорбента и его количеством в колонке, а также константой адсорбционного равновесия (константой Генри).

Коэффициент селективности α определяется различием констант адсорбционного равновесия двух разделяемых компонентов. При увеличении α (от 1 до ~ 5) R S резко возрастает, при дальнейшем увеличении α - меняется мало. Селективность колонки зависит от таких факторов, как химическая структура поверхности сорбента, состав элюента, температура колонки и строение разделяемых соединений. Так как сорбция хроматографируемых веществ в жидкостной хроматографии определяется попарным взаимодействием трех основных компонентов системы - сорбента, разделяемых веществ и элюента, то изменение состава элюента – это удобный способ оптимизации процесса разделения.

Эффективность колонки зависит от размера частиц и структуры пор адсорбента, от равномерности набивки колонки, вязкости элюента и скорости массообмена. Удлинение колонки не всегда приводит к улучшению разделения, так как возрастает сопротивление колонки, увеличивается давление элюента на входе и время проведения опыта, снижается чувствительность и точность анализа из-за уширения пика анализируемого компонента. Если , то пики двух веществ на хроматограмме разделяются практически полностью. С ростом R S увеличивается время разделения. При R S < 1 - разделение неудовлетворительное. В препаративной хроматографии в связи с введением сравнительно больших количеств разделяемых веществ колонка работает с перегрузкой. При этом снижается коэффициент емкости, возрастает высота, эквивалентная теоретической тарелке, что приводит к уменьшению разрешения.

4. Адсорбенты

Хроматографическое разделение смеси будет эффективным, если правильно подобраны адсорбент и растворитель (элюент).

Адсорбент не должен химически взаимодействовать с разделяемыми компонентами, проявлять каталитическое воздействие на растворитель. Также необходимо, чтобы адсорбент обладал избирательностью по отношению к компонентам смеси. Правильно подобранный адсорбент должен иметь максимальную поглотительную способность.

Различают полярные (гидрофильные) и неполярные (гидрофобные) адсорбенты . Следует помнить о том, что адсорбционное сродство полярных веществ к полярным сорбентам значительно выше, чем неполярных.

В качестве адсорбентов применяют оксид алюминия, активированные угли, силикагель, цеолиты, целлюлозу и некоторые минералы.

Оксид алюминия Al2 O3 – амфотерный адсорбент .(рис.) На нем можно разделять смеси веществ в полярных , так и в неполярных растворителях . Нейтральный оксид алюминия используют обычно для хроматографирования из неводных растворов предельных углеводородов, альдегидов, спиртов, фенолов, кетонов и эфиров.

Рис. Оксид алюминия для хроматографии

http://images. /542857_w200_h200_product5.jpg

Активность Al2O3 зависит от содержания в нем влаги. Самую высокую активность имеет безводный оксид алюминия. Её условно принимают за единицу. При необходимости можно приготовить оксид алюминия с различным содержанием влаги путем смешения свежеприготовленного оксида алюминия с водой (шкала Брокмана).

Зависимость активности оксида алюминия от содержания влаги

Например, для разделения углеводородов применяют Al2O3 с активностью 1,5-2; для разделения спиртов и кетонов – 2-3,5.

Удельная поверхность оксида алюминия 230-380 м2/г.

Силикагель (гидроксилированный или химически модифицированный) – это высушенный желатинообразный диоксид кремния, который получают из пересыщенных растворов кремниевых кислот (n SiO2·m H2O) при pH > 5-6. (рис.) Твёрдый гидрофильный сорбент.

Рис. Силикагель

http://www. silicagel. /

http://silikagel. ru/images/askg. gif

Размер частиц силикагеля в аналитических колонках 3-10 мкм, в препаративных - 20-70 мкм. Малый размер частиц увеличивает скорость массообмена и повышает эффективность колонки. Современные аналитические колонки имеют длину 10-25см. Они заполнены силикагелем с размером частиц 5 мкм и позволяют разделить сложные смеси из 20-30 компонентов. При уменьшении размера частиц до 3-5 мкм возрастает эффективность колонки, но и растет ее сопротивление. Так для достижения скорости потока элюента 0,5-2,0 мл/мин требуется давление (1-3)·107Па. Силикагель выдерживает такой перепад давления, гранулы же полимерных сорбентов более эластичны и деформируются. В последнее время разработаны механически прочные полимерные сорбенты макропористой структуры с густой сеткой, которые по своей эффективности приближаются к силикагелям. Форма частиц сорбента размером 10 мкм и выше не оказывает большого влияния на эффективность колонки, однако предпочитают сорбенты сферической формы, которые дают более проницаемую упаковку.(рис.)

Рис. Силикагель сферической формы

http://images. /6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http:///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Внутренняя структура частицы силикагеля представляет собой систему сообщающихся каналов. Для жидкостной хроматографии используют сорбенты с диаметром пор 6-25 нм. Разделение жидкостной хроматографии в проводят, в основном, на силикагелях, модифицированных реакцией алкил - и арилхлорсиланов или алкилэтоксисиланов с силанольными группами поверхности. С помощью таких реакций прививают группы С8Н17-, С18Н37- или С6Н5- (для получения сорбентов с гидрофобизированной поверхностью), нитрильные, гидроксильные группы и др. (рис.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg" width="166" height="116 src=">

Рис. Структура модифицированного силикагеля

Силикагели используют в хроматографии для разделения смесей нефтепродуктов, высших жирных кислот, их сложных эфиров, ароматических аминов, нитропроизводных органических соединений . Силикагель – гидрофильный сорбент , легко смачивается водой. Поэтому его нельзя использовать для сорбции из водных растворов. Активность силикагеля зависит от содержания в нем воды: чем меньше в нем воды, тем больше активность (шкала Брокмана).

Зависимость активности силикагеля от содержания влаги

Удельная поверхность силикагелей равна 500-600 м2/г.

Активированные угли являются формой углерода, который в процессе обработки становится чрезвычайно пористым и приобретает очень большую площадь поверхности, предназначенную для адсорбции или химических реакций.(рис.) Они имеют удельную поверхность 1300-1700 м2/г.

Рис. Активированный уголь

http://e-catalog. rusbiz. ru/user_images/ru/prod_picture/58035161249b9016f64372.jpg

Основное влияние на структуру пор активированных углей оказывают исходные материалы для их получения. Активированные угли на основе скорлупы кокосов характеризуются большей долей микропор (до 2 нм), на основе каменного угля - большей долей мезопор (2-50 нм). Большая доля макропор характерна для активированных углей на основе древесины (более 50 нм). Микропоры особенно хорошо подходят для адсорбции молекул небольшого размера, а мезопоры - для адсорбции более крупных органических молекул.

Цеолиты (молекулярные сита) – пористые кристаллические алюмосиликаты щелочных и щелочноземельных металлов природного и синтетического происхождения. (рис.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg" width="211 height=211" height="211">

Рис. Цеолиты

http://www. zeolite. spb. ru/_img/_36mm. jpg

http://kntgroup. ru/thumb. php? file=/uploads/produkts/6.jpg&x_width=250

Известны четыре типа цеолитов (A, X, Y, M), имеющие различную кристаллическую структуру. В зависимости от катиона цеолиты обозначают следующим образом: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Особенностью цеолитов является то, что поры кристаллов имеют размеры порядка 0,4-1 нм, соизмеримые с размерами молекул многих жидких или газообразных веществ. Если молекулы вещества способны проникать в эти поры, то происходит адсорбция в порах кристаллов цеолитов. Более крупные молекулы вещества не адсорбируются. Подбирая цеолиты с разными размерами пор, можно четко разделить смеси различных веществ.

Удельная поверхность цеолитов 750-800 м2/г.

При выборе адсорбента необходимо учитывать строение веществ и их растворимость. Например, предельные углеводороды адсорбируются плохо, а непредельные (имеют двойные связи) – лучше. Функциональные группы усиливают способность вещества к адсорбции.

5. Элюенты

При выборе растворителя (элюента) нужно учитывать природу адсорбента и свойства веществ в разделяемой смеси. Элюенты должны хорошо растворять все компоненты хроматографируемой смеси, обладать низкой вязкостью, обеспечивать необходимый уровень селективности, быть дешевыми, нетоксичными, инертными, совместимыми с методами детектирования (например, с УФ детектором нельзя использовать в качестве элюента бензол).

В нормально-фазной хроматографии обычно используют углеводороды (гексан, гептан, изооктан, циклогексан) с добавлением небольших количеств хлороформа СНСl3, изо-пропанола изо-С3Н7ОН, диизопропилового эфира; в обращенно-фазной хроматографии - смесь воды с ацетонитрилом CH3CN, метанолом СН3ОН, этанолом С2Н5ОН, диоксаном, тетрагидрофуран, диметилформамид. Для выделения отдельных компонентов смеси, разделившихся при хроматографировании, часто проводят их последовательное вымывание (элюирование). С этой целью применяют растворители с различной десорбционной способностью. Растворители располагают в порядке убывания десорбирующей способности в полярных адсорбентах – элюотропный ряд Траппе . Если компоненты разделяемой смеси имеют близкие значения k" (коэффициент емкости колонки по отношению к данному компоненту), то хроматографируют одним элюентом. Если отдельные компоненты смеси сильно удерживаются сорбентом, используют серию элюентов возрастающей силы.

Элюотропный ряд растворителей

6. Аппаратура для жидкостной хроматографии

В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем до хроматографов высокого класса.
Современный жидкостной хроматограф включает: емкости для элюентов, насосы высокого давления, дозатор, хроматографическую колонку, детектор, регистрирующий прибор, систему управления и математические обработки результатов.

На рис. представлена блок-схема жидкостного хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде, присутствующих в любой хроматографической системе.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg" width="361" height="254 src=">

Рис. Схема жидкостного хроматографа: 1- резервуар для подвижной фазы, 2- насос, 3- инжектор, 4- колонка, 5- термостат, 6- детекторы, 7- регистрирующая система,8- компьютер.

Резервуар для подвижной фазы, должен иметь достаточную для проведения анализа вместимость и устройство для дегазации растворителя , чтобы исключить образование в колонке и детекторе пузырьков растворенных в элюенте газов.

Насос предназначен для создания постоянного потока растворителя . Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используют насосы плунжерного (шприцевого) типа. Недостатком их является необходимость периодических остановок для заполнения элюентом. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями 1-5 МПа применяют недорогие перистальтические насосы. Элюенты поступают в насос через фильтр, задерживающий пылевые частицы (больше 0,2 мкм). Иногда через элюенты пропускают небольшой ток гелия для удаления растворенного воздуха и предотвращения образования пузырьков в детекторе (особенно в случае водных и полярных элюентов). В аналитических хроматографах для подачи элюента в колонку используют поршневые насосы с системой обратной связи, позволяющие сглаживать пульсацию потока в пределах 1-2% и обеспечивать объемные скорости от 0,1 до 25 мл/мин при давлении до ~ 3.107 Па. В микроколоночной хроматографии объемные скорости потока элюента значительно ниже - 10-1000 мкл/мин. В случае градиентного элюирования используют несколько насосов, которые управляются программатором и подают в камеру смешения 2-3 компонента элюента, оставляя постоянной общую скорость потока. Для введения пробы в колонку, находящуюся под большим давлением, без остановки потока используют специальные микродозирующие краны, связанные с петлей известного объема для исследуемой пробы раствора. Разработаны дозировочные системы с автоматическим отбором и вводом пробы с помощью микродозирующих кранов или шприцов.

Инжектор обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокой воспроизводимостью. Простые системы ввода пробы - "stop-flow" требуют остановки насоса и, поэтому, менее удобны, чем петлевые дозаторы, разработанные фирмой Reodyne.

Колонки для ВЭЖХ изготовляют чаще всего из нержавеющей стальной полированной трубки длиной 10-25см и внутренним диаметром 3-5мм.

Рис. Хроматографические колонки для жидкостной хроматографии

Используют также стеклянные колонки , помещенные в металлический кожух; в микроколоночной хроматографии - набивные металлические колонки с внутренним диаметром 1,0-1,5мм, набивные стеклянные микроколонки диаметром 70-150 мкм и полые капиллярные колонки диаметром 10-100 мкм; в препаративной хроматографии - колонки диаметром от 2 до 10см и более. Для равномерного и плотного заполнения колонок сорбентом используют суспензионный метод набивки. Суспензию готовят из сорбента и подходящей органической жидкости, которая подается под давлением до 5·107 Па в колонку. Для определения выходящих из колонки разделенных компонентов используют детекторы . Постоянство температуры обеспечивается термостатом .

Детекторы для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Они должны быть очень чувствительными. Для увеличения чувствительности детектора иногда применяют дериватизацию компонентов смеси после колонки. Для этого с потоком элюента вводят такие реагенты, которые, взаимодействуя с разделенными веществами, образуют производные с более выраженными свойствами, например, сильнее поглощают в УФ или видимой области спектра или обладают большей флуоресцирующей способностью. Иногда дериватизацию проводят до хроматографического анализа и разделяют производные, а не исходные вещества. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры , измеряющие показатель преломления , и спектрофотометрические детекторы , определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области). К достоинствам рефрактометров (и недостаткам спектрофотометров ) следует отнести низкую чувствительность к типу определяемого соединения , которое может и не содержать хромофорных групп. С другой стороны, применение рефрактометров ограничено изократическими системами (с постоянным составом элюента), так что использование градиента растворителей в этом случае невозможно.

Дифференциал" href="/text/category/differentcial/" rel="bookmark">дифференциального усилителя и самописца. Желательно также наличие интегратора , позволяющего рассчитывать относительные площади получаемых пиков. В сложных хроматографических системах используется блок интерфейса , соединяющий хроматограф с персональным компьютером , который осуществляет не только сбор и обработку информации , но и управляет прибором, рассчитывает количественные характеристики и, в некоторых случаях, качественный состав смесей. Микропроцессор обеспечивает автоматический ввод пробы , изменение по заданной программе состава элюента при градиентном элюировании, поддержание температуры колонки .

Bruker". Рис. Жидкостный хроматограф Jasco

Вопросы для самопроверки

Что такое жидкостная хроматография? Назовите её виды, области применения. Перечислите о сновные хроматографические величины и их определение Какие виды жидкостной хроматографии существуют в зависимости от механизма удерживания разделяемых веществ неподвижной фазой ЖХ? Какие виды хроматографии существуют в зависимости от способа перемещения вещества? Какие вещества используют в качестве адсорбентов? Чем они отличаются? Что служит жидкой подвижной фазой - элюентом? Требования к растворителям. В чем отличие распределительной хроматографии от адсорбционной хроматографии? Перечислите основные части схемы жидкостного хроматографа, их назначение.

Список использованной литературы

1 « Жидкостная хроматография в медицине »

Http://journal. issep. rssi. ru/articles/pdf/0011_035.pdf

2 « Ознакомление с методами высокоэффективной жидкостной хроматографии »

Http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

3 « Жидкостная хроматография »

Http://e-science. ru/index/?id=1540

4 « Хроматография »

Http://belchem. narod. ru/chromatography1.html

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медленного продвижения ПФ занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ)

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хроматографии, сделала ее одним из перспективных и современных методов анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и проведения качественного и количественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют 2 варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемая обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОфВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбентов и неводных ПФ. Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Аппаратура для ВЖХ

Колонки для ВЖХ выполняют из нержавеющей стали с внутренним диаметром 2-6 мм и длиной 10-25 см. Колонки заполняют сорбентом (НФ). В качестве НФ используются силикагель, оксид алюминия или модифицированные сорбенты. Модифицируют обычно силикагель, внедряя химическим путем в его поверхность различные функциональные группы.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хроматограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца последовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из колонки отдельных компонентов смеси. В случае разделения смеси на внешней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хроматограмме используют для целей идентификации вещества, высоту или площадь пика - для целей количественного определения.

Качественный анализ

Важнейшие характеристики хроматограммы - время удерживания t r и связанный с ней удерживаемый объем - отражают природу веществ, их способность к сорбции на материале неподвижной фазы и, следовательно, при постоянстве условий хроматографирования являются средством идентификации вещества. Для данной колонки с определенными скоростью потока и температурой время удерживания каждого соединения постоянно (рис), где t R(a) - время удерживания компонента А анализируемой смеси с момента ввода в колонку до появления на выходе из колонки максимума пика, t R(BC) - время удерживания внутреннего стандарта (первоначально отсутствующее в анализируемой смеси вещество), h - высота пика (мм), a 1/2 - ширина пика на половине его высоты, мм.

Для идентификации вещества по хроматограмме обычно используют стандартные образцы или чистые вещества. Сравнивают время удерживания неизвестного компонента t Rx с временем удерживания t RCT известных веществ. Но более надежна идентификация по измерению относительного времени удерживания

При этом в колонку сначала вводят известное вещество (внутренний стандарт) и измеряют время его удерживания t R(BC) , затем хроматографически разделяют (хроматографируют) исследуемую смесь, в которую предварительно добавляют внутренний стандарт.

Количественный анализ

В основе этого анализа лежит зависимость высоты пика h или его площади S от количества вещества. Для узких пиков предпочтительнее измерение h, для широких размытых - S. Площадь пика измеряют разными способами: умножением высоты пика (h) на его ширину (а 1/2), измеренную на половине его высоты; планиметрированием; с помощью интегратора. Электрическими или электронными интеграторами снабжены современные хроматографы.

Для определения содержания веществ в пробе используют в основном три метода: метод абсолютной градуировки, метод внутренней нормализации и метод внутреннего стандарта.

Метод абсолютной градуировки основан на предварительном определении зависимости между количеством введенного вещества и площадью или высотой пика на хроматограмме. В хроматограмму вводят известное количество градуировочной смеси и определяют площади или высота полученных пиков. Строят график зависимости площади или высоты пика от количества введенного вещества. Анализируют исследуемый образец, измеряют площадь или высоту пика определяемого компонента и на основании градировочного графика рассчитывают его количество.

Метод внутренней нормализации основан на приведении к 100% суммы площадей всех пиков на хроматограмме.

Этот метод дает информацию только об относительном содержании компонента в смеси, но не позволяет определить его абсолютную величину.

Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества, введенного в пробу в известном количестве. В исследуемую пробу вводят известное количество такого стандартного вещества, пик которого достаточно хорошо отделяется от пиков компонентов исследуемой смеси.

В последних двух методах требуется введение поправочных коэффициентов, характеризующих чувствительность используемых детекторов к анализируемым веществам. Для разных типов детекторов и разных веществ коэффициент чувствительности определяется экспериментально.

В жидкостной адсорбционной хроматографии используется также анализ фракций растворов, собранных в момент выхода вещества из колонки. Анализ может быть проведен различными физико-химическими методами.

Жидкостную адсорбционную хроматографию применяют в первую очередь для разделения органических веществ. Этим методом весьма успешно изучают состав нефти, углеводородов, эффективно разделяют - транс- и цис- изомеры, алкалоиды и др. С помощью ВЖХ можно определять красители, органические кислоты, аминокислоты, сахара, примеси пестицидов и гербицидов, лекарственных веществ и других загрязнителей в пищевых продуктах.

Аппаратура для жидкостной хроматографии.

В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем, до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами. На рис. 1. представлена блок-схема жидкостного хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде, присутствующих в любой хроматографической системе.

Рис. 1. Блок-схема жидкостного хроматографа.

Насос (2) предназначен для создания постоянного потока растворителя. Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используются насосы плунжерного (шприцевого), либо пистонного типов. Недостатком первых является необходимость периодических остановок для заполнения элюентом, а вторых - большая сложность конструкции и, как следствие, высокая цена. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями 1-5 МПа с успехом применяют недорогие перистальтические насосы, но так как при этом трудно добиться постоянства давления и скорости потока, их использование ограничено препаративными задачами.

Инжектор (3) обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокой воспроизводимостью. Простые системы ввода пробы - "stop-flow" требуют остановки насоса и, поэтому, менее удобны, чем петлевые дозаторы, разработанные фирмой Reodyne.

Колонки (4) для ВЭЖХ представляют собой толстостенные трубки из нержавеющей стали, способные выдержать высокое давление. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонки сорбентом. Для жидкостной хроматографии низкого давления с успехом используют толстостенные стеклянные колонки. Постоянство температуры обеспечивается термостатом (5).

Детекторы (6) для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры, измеряющие показатель преломления, и спектрофотометрические детекторы, определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области). К достоинствам рефрактометров (и недостаткам спектрофотометров) следует отнести низкую чувствительность к типу определяемого соединения, которое может и не содержать хромофорных групп. С другой стороны, применение рефрактометров ограничено изократическими системами (с постоянным составом элюента), так что использование градиента растворителей в этом случае невозможно.

Регистрирующая (7) система в простейшем случае состоит из дифференциального усилителя и самописца. Желательно также наличие интегратора, позволяющего рассчитывать относительные площади получаемых пиков. В сложных хроматографических системах используется блок интерфейса, соединяющий хроматограф с персональным компьютером (8), который осуществляет не только сбор и обработку информации, но и управляет прибором.

Детекторы для ВЭЖХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется для детектирования полярных нелетучих веществ, которые по каким-либо причинам не могут быть переведены в форму удобную для газовой хроматографии, даже в виде производных. К таким веществам, в частности, относят сульфоновые кислоты, водорастворимые красители и некоторые пестициды, например производные фенил - мочевины.

Детекторы:

УФ - детектор на диодной матрице. «Матрица» фотодиодов (их более двухсот) постоянно регистрирует сигналы в УФ- и видимой области спектра, обеспечивая таким образом запись УФ-В-спектров в режиме сканирования. Это позволяет непрерывно снимать при высокой чувствительности неискаженные спектры быстро проходящих через специальную ячейку компонентов.

По сравнению с детектированием на одной длине волны, которое не дает информации о «чистоте» пика, возможности сравнения полных спектров диодной матрицы обеспечивают получение результата идентификации с гораздо большей степенью достоверности.

Флуоресцентный детектор. Большая популярность флуоресцентных детекторов объясняется очень высокой селективностью и чувствительностью, и тем фактором, что многие загрязнители окружающей среды флуоресцируют (например, полиароматические углеводороды).

Электрохимический детектор используются для детектирования веществ, которые легко окисляются или восстанавливаются: фенолы, меркаптаны, амины, ароматические нитро- и галогенпроизводные, альдегиды кетоны, бензидины.

Индикаторные трубки для тест-определения ароматических аминов в воздухе рабочей зоны

Ароматические амины обладают высокими токсичными свойствами и характеризуются низкими значениями предельно допустимых концентраций в воздушной среде. Склонность к окислительной деградации этих загрязнителей в объектах окружающей среды ограничивает возможность оперативного контроля их содержания в местах локальных выбросов. Это определяет актуальность использования для оценки загрязнения различных сред аналитических систем, основанных на тест-определениях веществ. Тест-методы, к которым относят аналитические устройства с прямым, без дополнительных операций пробоотбора и пробоподготовки анализируемых образцов детектированием аналитического сигнала позволяют наиболее экономично и объективно получать информацию о состоянии окружающей среды.

Цель работы - разработка индикаторных трубок для тест-определения амино соединений в воздухе на основе нового, перспективного класса реагентов для молекулярного органического анализа хлординитрозамещенных бенз-2,1,3-оксадиазола и их N-оксидов.

Окраска образующихся производных зависит от природы определяемого соединения и наблюдаемый батохромный сдвиг полос поглощения определяется степенью замещения аминогруппы и наличием заместителей. Это позволяет использовать в основе тест-метода прямое визуальное детектирование аналитического сигнала. Пределы визуального обнаружения токсикантов достигают 0.05 мг/м 3 .

Разработанные индикаторные трубки использованы как эффективные хемосорбционные пробоотборники (химические дозиметры) для анализа воздуха, содержащего смесь аминосоединений. Экспериментально была установлена скорость пробоотбора по степени поглощения токсикантов селективным слоем. Состав и количество, например, замещенных анилинов можно определить после элюирования продуктов хемосорбции с силикагеля методом ВЭЖХ. При этом широкий круг потенциальных компонентов промышленных экосистем не влияет на результаты определений.



Жидкостно-адсорбционная хроматография на колонке

Разделение смеси веществ в адсорбционной колонке происходит в результате различия их в сорбируемости на данном адсорбенте (в соответствии с законом адсорбционного замещения, установленного М. С. Цветом).

Адсорбентами являются пористые тела с сильно развитой внутренней поверхностью, удерживающие жидкости с помощью межмолекулярных и поверхностных явлений. Это могут быть полярные и неполярные неорганические и органические соединения. К полярным адсорбентам относятся силикагель (высушенная желатинообразная двуокись кремния), оксид алюминия, карбонат кальция, целлюлоза, крахмал и др. Неполярные сорбенты - активированный уголь, порошок резины и множество других, полученных синтетическим путем.

К адсорбентам предъявляют следующие требования: S они не должны вступать в химические реакции с подвижной фазой и разделяемыми веществами; S должны обладать механической прочностью; S зерна адсорбента должны быть одинаковой степени дисперсности.

При выборе условий для хроматографического процесса учитывают свойства адсорбента и адсорбируемых веществ.

В классическом варианте жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) через хроматографическую колонку, представляющую собой стеклянную трубку диаметром 0,5 - 5 см и длиной 20 - 100 см, заполненную сорбентом (НФ), пропускают элюент (ПФ). Элюент движется под воздействием силы тяжести. Скорость его движения можно регулировать имеющимся внизу колонки краном. Анализируемую смесь помещают в верхнюю часть колонки. По мере продвижения пробы по колонке происходит разделение компонентов. Через определенные промежутки времени отбирают фракции выделившегося из колонки элюента, который анализируют каким-либо методом, позволяющим измерять концентрации определяемых веществ.

Колоночная адсорбционная хроматография в настоящее время применяется, главным образом не как самостоятельный метод анализа, а как способ предварительного (иногда и конечного) разделения сложных смесей на более простые, т.е. для подготовки к анализу другими методами (в том числе и хроматографическими). Например, на колонке с окисью алюминия разделяют смесь токоферолов, пропускают элюент и собирают фракцию а-токоферола для последующего определения фотометрическим методом.

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медленного продвижения ПФ занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ)

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хроматографии, сделала ее одним из перспективных и современных методов анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и проведения качественного и количественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют 2 варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемая об-ращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (Оф ВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбенгов и неводных ПФ. Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Аппаратура для ВЖХ

Комплект современного оборудования для ВЖХ, как правило, состоит из двух насосов 3,4 (рис. 7.1.1.1), управляемых микропроцессором 5, и подающих элюент по определенной программе. Насосы создают давление до 40 МПа. Проба вводится через специальное устройство (инжектор) 7 непосредственно в поток элюента. После прохождения через хроматографическую колонку 8 вещества детектируются высокочувствительным проточным детектором 9, сигнал которого регистрируется и обрабатывается микро-ЭВМ 11. При необходимости, в момент выхода пика автоматически отбираются фракции.

Колонки для ВЖХ выполняют из нержавеющей стали с внутренним диаметром 2 - 6 мм и длиной 10-25 см. Колонки заполняют сорбентом (НФ). В качестве НФ используются силикагель, оксид алюминия или модифицированные сорбенты. Модифицируют обычно силикагель, внедряя химическим путем в его поверхность различные функциональные группы.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хро-матограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца последовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из колонки отдельных компонентов смеси. В случае разделения смеси на внешней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хромато-грамме используют для целей идентификации вещества, высоту или площадь пика - для целей количественного определения.

Качественный анализ

Важнейшие характеристики хроматограммы - время удерживания tR и связанный с ней удерживаемый объем - отражают природу веществ, их способность к сорбции на материале неподвижной фазы и, следовательно, при постоянстве условий хроматографирования являются средством идентификации вещества. Для данной колонки с определенными скоростью потока и температурой время удерживания каждого соединения постоянно (рис.7.1.1.2), где t.R(A) - время удерживания компонента А анализируемой смеси с момента ввода в колонку до появления на выходе из колонки максимума пика, 1К(вс) - время удерживания внутреннего стандарта (первоначально отсутствующее в анализируемой смеси вещество), h - высота пика (мм), аш - ширина пика на половине его высоты, мм.

Для идентификации вещества по хроматограмме обычно используют стандартные образцы или чистые вещества. Сравнивают время удерживания неизвестного компонента IR* с временем удерживания IRCT известных веществ. Но более надежна идентификация по измерению относительного времени удерживания

При этом в колонку сначала вводят известное вещество (внутренний стандарт) и измеряют время его удерживания tR(Bc), затем хроматографиче-ски разделяют (хроматографируют) исследуемую смесь, в которую предварительно добавляют внутренний стандарт. Относительное время удерживания определяют по формуле (7.1.1.1).

Количественный анализ

В основе этого анализа лежит зависимость высоты пика h или его площади S от количества вещества. Для узких пиков предпочтительнее измерение h, для широких размытых - S. Площадь пика измеряют разными способами: умножением высоты пика (h) на его ширину (ai/2), измеренную на половине его высоты (рис.7.2.3); планиметрированием; с помощью интегратора. Электрическими или электронными интеграторами снабжены современные хроматографы.

Для определения содержания веществ в пробе используют в основном три метода: метод абсолютной градуировки, метод внутренней нормализации и метод внутреннего стандарта.

Метод абсолютной градуировки основан на предварительном определении зависимости между количеством введенного вещества и площадью или высотой пика на хроматограмме. В хроматограмму вводят известное количество градуировочной смеси и определяют площади или высота полученных пиков. Строят график зависимости площади или высоты пика от количества введенного вещества. Анализируют исследуемый образец, измеряют площадь или высоту пика определяемого компонента и на основании градировочного графика рассчитывают его количество.

Этот метод дает информацию только об относительном содержании компонента в смеси, но не позволяет определить его абсолютную величину.

Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества, введенного в пробу в известном количестве. В исследуемую пробу вводят известное количество такого стандартного вещества, пик которого достаточно хорошо отделяется от пиков компонентов исследуемой смеси

В последних двух методах требуется введение поправочных коэффициентов, характеризующих чувствительность используемых детекторов к анализируемым веществам. Для разных типов детекторов и разных веществ коэффициент чувствительности определяется экспериментально.

В жидкостной адсорбционной хроматографии используется также анализ фракций растворов, собранных в момент выхода вещества из колонки. Анализ может быть проведен различными физико-химическими методами.

Жидкостную адсорбционную хроматографию применяют в первую очередь для разделения органических веществ. Этим методом весьма успешно изучают состав нефти, углеводородов, эффективно разделяют-транс- и цис- изомеры, алкалоиды и др. С помощью ВЖХ можно определять красители, органические кислоты, аминокислоты, сахара, примеси пестицидов и гербицидов, лекарственных веществ и других загрязнителей в пищевых продуктах.