Študija fizikalnih in kemijskih lastnosti, kemična sestava in struktura je mogoča le pri preučevanju prečiščenega proteinskega pripravka. Za izolacijo in frakcioniranje posameznih proteinov uporabljamo soljenje, obarjanje z organskimi topili, gelsko filtracijo, elektroforezo, ionsko izmenjevalno kromatografijo in afinitetno kromatografijo.

Soljenje beljakovin temelji na odvisnosti topnosti beljakovin od lastnosti medija. V destilirani vodi se beljakovine topijo slabše kot v šibkih raztopinah soli, saj nizke koncentracije ionov ohranjajo svoje hidratacijske lupine. Toda pri visokih koncentracijah soli beljakovinske molekule izgubijo svoje hidratacijske lupine, se združijo in nastane oborina. Po odstranitvi soli beljakovine spet preidejo v raztopino, pri čemer ohranijo svoje naravne lastnosti in konformacijo.

Spremembe topnosti pri različnih koncentracijah soli in pH medija se uporabljajo za izolacijo posameznih proteinov. Najpogosteje se za soljenje beljakovin uporabljajo raztopine amonijevega sulfata različnih koncentracij.

Obarjanje beljakovin iz raztopine brez njihove denaturacije se izvaja z dehidrogenacijskimi sredstvi - organskimi topili (etanol, aceton).

Gelska filtracija Temelji na delitvi beljakovin glede na velikost in obliko molekule. Ločevanje poteka v kromatografskih kolonah, napolnjenih z zrnci poroznega gela (Sephadex, agaroza) v pufrski raztopini z določeno pH vrednostjo. Zrnca gela so prepustna za proteine ​​zaradi notranjih kanalov (por) z določenim povprečnim premerom, katerega velikost je odvisna od vrste gela (Sephadex G-25, G-200 itd.). Zmes proteinov vnesemo v kolono in jo nato izperemo (eluiramo) s pufersko raztopino z določeno pH vrednostjo. Velike beljakovinske molekule ne prodrejo v pore gela in se premikajo z veliko hitrostjo skupaj s topilom. Majhne molekule nečistoč z nizko molekulsko maso (soli) ali drugih beljakovin zadržijo zrnca gela in se počasneje izpirajo iz kolone (slika 1.29). Na izhodu iz kolone se raztopina (eluat) zbira kot ločene frakcije.

riž. 1.29. Ločevanje proteinov z gelsko filtracijo

elektroforeza temelji na lastnosti nabitih beljakovinskih molekul, da se gibljejo v električnem polju s hitrostjo, ki je sorazmerna njihovemu skupnemu naboju. Beljakovine, ki imajo pri določenem pH skupni negativni naboj, se premikajo proti anodi, pozitivnega pa proti katodi. Elektroforezo izvajamo na različnih medijih: papirju, škrobnem gelu, poliakrilamidnem gelu itd. Hitrost gibanja je odvisna od naboja, mase in oblike beljakovinskih molekul. Po končani elektroforezi se proteinske cone na nosilcu obarvajo s posebnimi barvili (slika 1.30, A).

Ločljivost elektroforeze v gelu je višja kot na papirju, zato se pri elektroforezi beljakovin krvnega seruma na papirju izolira 5 frakcij (albumini, α 1 -, α 2 -, β-, γ-globulini) in do 18 frakcij. frakcije v poliakrilamidnem gelu (slika 1.30, B).

riž. 1.30. Elektroferogram beljakovin v krvnem serumu zdrave osebe

AMPAK- elektroferogram beljakovin krvnega seruma na papirju;

B- količina plazemskih beljakovin različnih frakcij.

I - γ-globulini; II - β-globulini; III - a 2 -globulini;

IV - a 1 -globulini; V - albumini

Ionska izmenjevalna kromatografija temelji na ločevanju proteinov, ki se razlikujejo po skupnem naboju. Proteinska raztopina z določeno vrednostjo pH se spusti skozi kromatografsko kolono, napolnjeno s trdnim poroznim sorbentom, pri čemer se del beljakovin obdrži zaradi elektrostatične interakcije. Kot sorbent se uporabljajo ionski izmenjevalci: anionski izmenjevalci (ki vsebujejo kationske skupine) za izolacijo kislih beljakovin; kationski izmenjevalci (ki vsebujejo anionske skupine) za izolacijo bazičnih proteinov.

Ko gre protein skozi kolono, je moč njegove vezave na ionski izmenjevalec odvisna od velikosti naboja, ki je nasproten naboju sorbenta. Proteini, adsorbirani na ionsko izmenjevalnem sorbentu, se eluirajo s pufrskimi raztopinami z različnimi koncentracijami soli in pH, pri čemer dobimo različne beljakovinske frakcije.

Afinitetna kromatografija temelji na specifičnosti vezave proteina na ligand, vezan na trdno podlago. Kot ligandi se uporabljajo encimski substrati, protetične skupine holoproteinov, antigeni itd. Ko gre mešanica proteinov skozi kolono, je na ligand vezan le komplementarni protein (slika 1.31, A), vsi ostali pa pridejo ven z raztopino. Adsorbirani protein se eluira z raztopino z drugačno vrednostjo pH (slika 1.31, B). Ta metoda je zelo specifična in omogoča pridobivanje visoko prečiščenih beljakovinskih pripravkov.

Izolacija in čiščenje proteina običajno poteka v več fazah z različnimi metodami. Zaporedje korakov je izbrano empirično in se lahko razlikuje za različne beljakovine. Visoka stopnja čiščenja beljakovin je zelo pomembna tako pri njihovi uporabi kot zdravil (hormon inzulin itd.), kot pri diagnosticiranju različnih bolezni s spreminjanjem beljakovinske sestave tkiv, krvi, sline itd.

Nabor beljakovin v celicah različnih organov odraslega človeka je individualen in se skozi vse življenje ohranja relativno konstanten. Specializirana tkiva lahko vsebujejo posebne beljakovine, kot so hemoglobin v rdečih krvničkah, aktin in miozin v mišicah, rodopsin v mrežnici, različni tipi kolagen v kostnem in vezivnem tkivu. Nekatere beljakovine najdemo v številnih tkivih, vendar v različnih količinah. Izbrana sestava se spremeni

riž. 1.31. Ločevanje proteinov z afinitetno kromatografijo

AMPAK- vezava izločenega proteina na specifičen ligand, vezan na nevtralni nosilec; B- pridobivanje raztopine posameznega proteina

beljakovine tkiv in krvi so možne in so povezane predvsem s prehrano, sestavo hrane in telesno aktivnostjo osebe.

Pri boleznih se lahko beljakovinska sestava krvnih in tkivnih celic bistveno spremeni, pogosto pride do pomanjkanja beljakovin ali zmanjšanja njihove aktivnosti - proteinopatija. Zato se določanje izrazitih sprememb v beljakovinski sestavi krvi in ​​tkiv uporablja za diagnosticiranje različnih bolezni v kliničnih preskušanjih.

Značilnosti strukture in delovanja telesa so odvisne od nabora beljakovin, ki se v njem sintetizirajo. Preučevanje strukture in lastnosti beljakovin je nemogoče brez njihove izolacije iz celice in čiščenja od drugih beljakovin in organskih molekul. Faze izolacije in čiščenja posameznih proteinov:

1 Uničenje celic proučevanega tkiva in pridobitev homogenata.

2 Ločevanje homogenata na frakcije centrifugiranje, pridobivanje jedrske, mitohondrijske, citosolne ali druge frakcije, ki vsebuje želeni protein.

3 Selektivna toplotna denaturacija- kratkotrajno segrevanje beljakovinske raztopine, pri katerem lahko odstranimo del denaturiranih beljakovinskih nečistoč (v primeru, da je beljakovina relativno termično stabilna).

4 Soljenje. Različni proteini se oborijo pri različnih koncentracijah soli v raztopini. S postopnim povečevanjem njegove koncentracije je mogoče dobiti več posameznih frakcij s prevladujočo vsebnostjo izločenega proteina v eni od njih. Najpogosteje uporabljena frakcionacija beljakovin je amonijev sulfat. Beljakovine z najmanjšo topnostjo se oborijo pri nizkih koncentracijah soli.

5 Gelska filtracija- metoda molekularnega presejanja molekul skozi nabrekla zrnca Sephadex (tridimenzionalne polisaharidne verige dekstrana s porami). Hitrost prehajanja beljakovin skozi kolono, napolnjeno s Sephadexom, bo odvisna od njihove molekularna teža: manjša kot je masa molekul, lažje prodrejo v granule in se tam dlje zadržijo, večja kot je masa, hitreje se eluirajo iz kolone.

6 Ultracentrifugiranje- metoda, ki sestoji iz dejstva, da se beljakovine v centrifugalni epruveti namestijo v rotor ultracentrifuge. Ko se rotor vrti, je hitrost sedimentacije beljakovin sorazmerna z njihovo molekulsko maso: težji proteini tvorijo frakcije, ki se nahajajo bližje dnu kivete, lažji - na površini.

7 Elektroforeza- metoda, ki temelji na razlikah v hitrosti gibanja proteinov v električnem polju. Ta vrednost je sorazmerna z nabojem beljakovin. Elektroforezo proteinov izvajamo na papirju (pri čemer je hitrost proteinov sorazmerna le z njihovim nabojem) ali v poliakrilamidnem gelu z določeno velikostjo por (hitrost proteinov je sorazmerna z njihovim nabojem in molekulsko maso).

8 Ionska izmenjevalna kromatografija- metoda frakcioniranja, ki temelji na vezavi ioniziranih skupin proteinov z nasprotno nabitimi skupinami ionsko izmenjevalno netopnih polimerov. Moč vezave smole sorazmeren z nabojem proteina. Proteini, adsorbirani na ionsko izmenjevalnem polimeru, se lahko sperejo z naraščajočimi koncentracijami NaCl; manjši kot je naboj proteina, nižja koncentracija NaCl bo potrebna za izpiranje proteina, vezanega na ionske skupine smole.

9 Afinitetna kromatografija- najbolj specifična metoda za izolacijo posameznih proteinov. Proteinski ligand je kovalentno vezan na inertni polimer. Pri prehajanju raztopine proteina skozi kolono s polimerom se zaradi komplementarne vezave proteina na ligand na koloni adsorbira samo protein, specifičen za ta ligand.

10 Za odstranitev spojin z nizko molekulsko maso iz raztopine izoliranega proteina, dializa. Metoda temelji na nezmožnosti proteinov, da prehajajo skozi polprepustno membrano, ki zlahka prehaja snovi z nizko molekulsko maso, zlasti soli. Uporablja se za čiščenje beljakovin iz nečistoč z nizko molekulsko maso, na primer iz soli po soljenju.

Naloge

1 Določite skupni naboj pentapeptida pri pH 7,0:

Glu-Arg-Liz-Val-Asp

Kako se bo spremenil skupni naboj tega peptida:

a) pri pH<7,0;

b) pri pH > 7,0?

2 Določite IEP peptidov (>,< или =7,0):

a) Pro-Liz-Tir-Gln-Tri;

b) Ala-Ser-Glu-Asn-Met.

3 Primerjajte smer gibanja v električnem polju dveh peptidov pri pH 7,0 (proti katodi ali anodi):

a) Val-Glu-Ala;

b) Ley-Asn-Arg.

4 Primerjajte topnost obeh peptidov pri pH 7,0:

Ser-Cis-Glu-Tir-Asp;

Val-Arg-Met-Fen-Tyr.

5 Jedrni histonski proteini vsebujejo veliko število aminokislinskih ostankov arginina in lizina, v krvnem proteinu albuminu pa je veliko ostankov glutaminske in asparaginske kisline. Odgovori na vprašanja:

a) v kakšnih okoljih (>,< или =7,0) лежит ИЭТ этих белков?

b) S katerim od obeh proteinov lahko sodeluje Ca 2+?

6 Povežite oštevilčeno metodo ločevanja in čiščenja beljakovin z njihovimi lastnostmi, na katerih temelji metoda:

A) Razlike v velikosti naboja.

B) Razlike v molekulski masi.

D) Brez.

1 Gelska filtracija.

2 Elektroforeza v poliakrilamidnem gelu.

3 Afinitetna kromatografija.

4 Ionska izmenjevalna kromatografija.

A) ultracentrifugiranje.

B) Gelska filtracija.

C) Elektroforeza v poliakrilamidnem gelu.

D) Ionsko izmenjevalna kromatografija.

D) Afinitetna kromatografija.

1 Uporablja se za ločevanje beljakovin od soli.

2 Metoda temelji na pritrditvi proteina na imobiliziran ligand.

3 Metoda temelji na uporabi razlik v molekulski masi in naboju proteinov.

8 Izberite metode, s katerimi lahko mešanico beljakovin ločite na posamezne beljakovine; navedite fizikalno-kemijske lastnosti beljakovin, na katerih temelji vsaka metoda.

9 Kako skupni naboj proteina vpliva na njegovo topnost:

a) določite skupni naboj peptida pri pH 7,0

Ala-Glu-Tre-Pro-Asp-Liz-Cis;

b) kako se bo spremenil naboj tega peptida pri pH >7,0, pH<7,0, рН<<7,0?

c) kakšna je izoelektrična točka (IEP) proteina in v katerem mediju leži IEP danega peptida?

d) pri kateri pH vrednosti bo opažena najmanjša topnost tega peptida?

10 Zakaj kislo mleko, za razliko od svežega mleka, pri prekuhavanju koagulira (t.j. kazeinske mlečne beljakovine se oborijo)? Molekule kazeina v svežem mleku imajo negativen naboj.

11 Reši nalogo Zmes, ki vsebuje proteine ​​A, B in C z molekulsko maso 160.000, 80.000 in 60.000 D, je bila analizirana z gelsko filtracijo. Granule nabreklega gela so prepustne za proteine ​​z mol. ki tehtajo manj kot 70.000 D. Navedite možne variante vrstnega reda sproščanja proteinov A, B in C iz kolone.

12 Primerjajte uporabo metode dialize in gelske filtracije:

1 Metoda se uporablja za čiščenje beljakovin iz nizkomolekularnih spojin.

2 Metoda se uporablja za frakcioniranje makromolekulskih snovi glede na razliko v molekulski masi.

3 Metoda se uporablja za ločevanje proteinov po neto naboju.

4 Metoda se uporablja za določanje molekulske mase.

A) Značilno za dializo.

B) Tipično za gelsko filtracijo.

C) Značilno je za obe metodi.

D) Ni značilno za nobenega od njih.

5.3 Varnostna vprašanja

1 Kaj določa topnost beljakovin?

2 Opišite korake pri izolaciji in čiščenju beljakovin. Kaj je liofilizacija?

3 Molekulska masa beljakovin in metode za njeno določanje.

4 Amfoterične lastnosti proteinov. izoelektrična točka.

Bibliografija

1 Biokemija // ed. E.S. Severina, A.Y. Nikolaeva. - M: GEOTAZ-MED. 2001. - 449s.

2 Plastinina Z.A., Zhamsaranova S.D. Navodila za samopripravo na laboratorijske vaje biološke kemije. - Ulan-Ude: Založba ESGTU, 2003. - 109 str.

3 Filippovič Yu.B. Biokemija beljakovin in nukleinskih kislin. - M.: Razsvetljenje. 1978. - 203 str.

4 Anisimov A.A. itd. Osnove biokemije. - M.: Višje. šola, 1985. - 398s.

5 Filippovič Yu.B., Egorova T.A., Sevastjanova G.A. Delavnica splošne biokemije. - M .: Razsvetljenje, 1982. - 157 str.

6 Ostroumov S.A. Uvod v biokemijsko ekologijo. - M.: Mir, 1986. -

7 Williams B., Wilson K. Metode praktične biokemije. - M.: Mir, 1978. - 268 str.

Na katerih fizikalno-kemijskih lastnostih beljakovin lahko temeljijo metode njihovega ločevanja? Prvič, to je velikost molekule, njena geometrija. Na uporabi te lastnosti temeljijo metode gelske kromatografije in ultrafiltracije, deloma elektroforeze v gelih.

Drugič, porazdelitev nabitih skupin, značilnih za določen protein na njeni površini . Razmerje kationskih in anionskih skupin v proteinu se spreminja glede na pH, izoelektrične točke proteinov - pI (vrednosti pH, pri katerih sta pozitivni in negativni naboj proteina popolnoma kompenzirana in je skupni naboj enak nič) se bistveno razlikujejo v različne beljakovine. Znano je, da so beljakovine v fizioloških pogojih kationske, anionske ali molekule brez opazne prevlade enega ali drugega naboja. Njihovo ločevanje z elektroforezo, izoelektričnim fokusiranjem, izoelektrično in ionsko izmenjevalno kromatografijo temelji na razliki v naboju proteinov pri različnih pH. Vendar pa ni pomembno le razmerje nabitih skupin, ki določa vrednost pI. Proteini s podobnimi izoelektričnimi točkami se lahko razlikujejo v porazdelitvi nabitih funkcionalnih skupin po površini globule. Tudi slednji so nameščeni bolj ali manj enakomerno; nasprotno, tvorijo lokalne skupke, skupke enako nabitih skupin, kar vpliva na ionsko izmenjevalno kromatografijo proteina.

Tretjič, proteini se razlikujejo po številu in naravi hidrofobnih površin, kar se uporablja v hidrofobni kromatografiji

Upoštevajte, da nobena od zgoraj obravnavanih lastnosti sama po sebi ne more zagotoviti izolacije posameznega proteina iz kompleksne mešanice – niso dovolj značilne in ne zagotavljajo selektivnosti čiščenja. V tem pogledu veliko bolj obetaven

uporabite za poudarjanje funkcionalnih lastnosti beljakovine. Dejansko je med mnogimi proteini v izhodnem materialu veliko takih, ki imajo podobno molekulsko maso ali blizu izoelektrične točke, vendar bo število na primer fosfataz ali amilaz zagotovo majhno. Očitno je metoda izolacije, ki temelji na sposobnosti teh encimov za interakcijo s svojim specifičnim substratom, neprimerljivo bolj selektivna kot katera koli metoda, ki temelji na različnosti fizikalno-kemijskih lastnosti.

Sheme za izolacijo proteinov samo po enem principu so redke, običajno se različni pristopi frakcioniranja kombinirajo in dopolnjujejo.

Ločevanje proteinov po molekulski masi. Gelska kromatografija (gelska filtracija)

Ta metoda uporablja granulirane gele premreženi hidrofilni materiali, dekstran (sefadeks, sefaroza in njuni analogi), poliakrilamid (biogeli in njihovi analogi), polivinilalkohol (toyoperl). Granule tvori tridimenzionalna mreža polimera, ki je neprepustna za velike molekule, delno prepustna za molekule vmesne velikosti in zelo prepustna za majhne molekule, soli in vodo. Odvisno od povprečne velikosti celice polimernega gela in geometrije molekule slednjega je na voljo večji ali manjši del skupne prostornine granul gela.

Ko se raztopina, ki vsebuje beljakovine in druge molekule, premika vzdolž kolone, napolnjene z nabreklimi zrnci gela, se komponente mešanice, ki so prodrle v gel, v njej zadržijo. Tako zaostajajo za večjimi molekulami, ki ne morejo vstopiti v zrnca in so samo v raztopini, ki jih pere. Ker niso vključene v gel, se velike molekule pojavijo v eluatu takoj, ko gre skozi kolono "prosta" prostornina raztopine, ki je enaka prostornini raztopine med zrnci gela. Slednja je določena z gostoto pakiranja in geometrijo granul. Za sferične delce, v obliki katerih se običajno proizvajajo materiali za gelsko kromatografijo, je prosti volumen 30–35% celotnega volumna kolone.

Če je velikost beljakovinskih molekul takšna, da lahko prodrejo v pore, ki sestavljajo določen del prostornine granul, bo opaziti zakasnitev elucije in beljakovina se bo pojavila v volumnu V e, povezanem z koeficient razpoložljivosti (delež prostornine granul, ki je na voljo tej vrsti molekul) z razmerjem:

kjer je V skupna prostornina kolone, minus tisti njen del, ki pade na sam polimer, ki tvori gel.

Vsak protein ima glede na velikost svoje molekule svojo vrednost, na podlagi katere je bila razdeljena z gelsko kromatografijo. Jasno je, da če je elucijski volumen blizu prostega volumna, se nagiba k ničli in ločevanje beljakovin, katerih molekule praktično ne vstopijo v gelske pore, ne bo prišlo. Na enak način se molekule majhnih velikosti, za katere je prepusten celoten volumen gela (V e je blizu in teži k enoti), ne bodo ločile v gelu s temi lastnostmi. Najboljšo ločljivost dosežemo, če je v območju od 0,4 do 0,6. Seveda lahko meje ločevanja razširimo z uporabo gelov z velikimi porami za beljakovine z visoko molekulsko maso in gelov s finimi porami za majhne.

Strogo gledano, pri gelski kromatografiji ločevanje proteinov ni določeno z molekulsko maso, temveč z geometrijskimi dimenzijami molekule. Skladno s tem molekule podolgovate oblike zaradi "kucanja" v raztopini težje prodrejo v gele kot sferične molekule enake molekulske mase. To pojasnjuje zgodnjo elucijo denaturiranih proteinov, ki se obnašajo kot neurejena ohlapna tuljava in ne kot kompaktna globula.

Enostavno razmerje med volumnom elucije in molekulsko maso proteina (velja seveda le za kompaktne sferične molekule) in enostavnost eksperimentiranja je naredila gelsko kromatografijo priljubljeno metodo za določanje molekulske mase proteinov. V ta namen kolono, napolnjeno z ustreznim gelom, kalibriramo z naborom proteinov z znanimi molekulskimi masami, nato določimo elucijski volumen proučevanega proteina in z interpolacijo izračunamo njegovo molekulsko maso. Natančnost metode ni zelo visoka, vendar je povsem zadostna za večino težav, ki se pojavljajo v praksi.

Pri uporabi te metode je treba upoštevati omejitve, ki nastanejo zaradi dejstva, da material za tvorjenje gela ni popolnoma inerten, kot nakazuje teorija metode, in lahko interagira s snovmi, ki jih je treba ločiti, kar izkrivlja odvisnost volumna elucije od velikosti molekule. To še posebej velja pri ločevanju majhnih količin beljakovin, saj je sorpcijska zmogljivost matrice gela nizka in v obsežnih poskusih njena interakcija z beljakovinami malo vpliva na proces.

Vezavo proteinov z materiali, ki tvorijo gel, lahko povzročijo interakcije ionske izmenjave, zlasti vsebnost negativno nabitih skupin v polisaharidnih matricah (Sepharose, Sephadex), pa tudi v poliakrilamidnih materialih. Pri slednjih karboksilne skupine nastanejo med spontano hidrolizo amidov, pri polisaharidih pa lahko nastanejo kot posledica oksidacije. Zakasnitev gelske kromatografije, ki jo povzročajo interakcije ionske izmenjave z matriksom, je še posebej značilna za kationske proteine, kot so lizocim in nekateri subtilizini. Pogosto je zelo pomembno in lahko celo prepreči ločevanje soli od beljakovin. V analitičnih poskusih je mogoče takšno zadrževanje zatreti s pomembnim povečanjem ionske moči raztopine.

Drug razlog za nenormalno zadrževanje snovi v gelski kromatografiji, še posebej opazno pri izolaciji majhnih molekul, kot so peptidi. -- hidrofobna vezava na matriko gela.

Vključeni so hidrofobni elementi hidrofilne polisaharidne matrike, kadar jih med sintezo Sephadexa obdelamo s sredstvi za navzkrižno povezovanje, zlasti z epiklorohidrinom. Peptidi, ki vsebujejo hidrofobne, zlasti aromatske ostanke (fenilalain, triptofan), so včasih tako močno zadržani v matriksu, da se v eluatu pojavijo pozneje kot anorganske soli.

Ločljivost metode ni zelo visoka, hkrati pa sta njena nesporna prednost enostavnost izvedbe in blagi eksperimentalni pogoji. Uporabnost metode na prvih stopnjah čiščenja omejuje dejstvo, da za zadovoljivo frakcioniranje beljakovin volumen uporabljene raztopine ne sme presegati

3-5% celotne prostornine kolone. Glede na to se gelska kromatografija običajno uporablja v srednji ali končni fazi izolacije beljakovin. Seveda je lahko pri ločevanju nečistoč z nizko molekulsko maso, zlasti med razsoljevanjem, prostornina vzorca veliko večja, saj visoka ločljivost ni potrebna. V tako poenostavljeni izvedbi se še posebej pogosto uporablja gelska filtracija.

Kljub tem omejitvam je gelska kromatografija priročna metoda za frakcioniranje beljakovin. Uporablja se tudi za ločevanje nizkomolekularnih nečistoč, vključno s solmi, od beljakovin.

V zadnjem času so poleg materialov za tvorbo gela za ločevanje beljakovin po velikosti uporabljeni makroporozni anorganski materiali. nosilci -- makroporozno steklo in silikagel. Običajno je površina teh materialov prevlečena s hidrofilnimi organskimi snovmi, da se prepreči nepovratna sorpcija beljakovin. Togost teh materialov omogoča ločevanje beljakovin glede na velikost molekul pri povišanih tlakih, kar pospeši proces in zmanjša motnje zaradi difuzije.

Sestava in količina beljakovinskih frakcij v bioloških tekočinah je odvisna od uporabljene metode frakcioniranja:

1. Padavine

• nevtralne soli(izsoljenje) - sposobnost plazemskih beljakovin, da se oborijo, ko so izpostavljeni solnim raztopinam različnih koncentracij,
• etilni alkohol pri nizki temperaturi;

2. Elektroforetsko frakcioniranje- Obstaja več vrst elektroforeze glede na nosilni medij. Kot nosilni mediji se uporabljajo papir, celulozno acetatni film, agar, poliakrilamid, škrobni geli. Pri izvajanju elektroforeze je treba upoštevati dejavnike, ki vplivajo na mobilnost snovi, ki jih je treba ločiti:

• naboj (običajno odvisen od pH), velikost in oblika molekul snovi;
• električno polje: hitrost migracije ionov je premo sorazmerna z jakostjo toka zaradi prenosa pufra in ionov vzorca, napetostjo in obratno sorazmerna z uporom (odvisna od vrste in velikosti nosilca ter ionske jakosti pufra);
• tip pufra : sestava, koncentracija, pH, ionska moč. Ionska moč je enaka vsoti n komponent: c n z n 2 / 2, kjer je c n molska koncentracija n-tega iona, z je naboj tega iona;
• nosilec: upoštevana je njegova hidrofilnost, adsorpcija snovi na nosilnih molekulah, elektroosmoza, difuzija.

3. Imunološke metode- na osnovi imunskih lastnosti beljakovinskih frakcij: imunoelektroforeza, elektroimunodifuzija, radialna imunodifuzija, radioimunotest;

4. Sedimentacijska analiza- na podlagi različne odvisnosti hitrosti sedimentacije beljakovin od mase in velikosti njihovih molekul;

5. Ionska izmenjava, adsorpcija, porazdelitev, afinitetna kromatografija, gelska filtracija.

Najpogostejša metoda frakcioniranja je elektroforeza, ki temelji na različni hitrosti gibanja beljakovin v električnem polju, odvisno od količine naboja in molekulske mase. Število izoliranih frakcij je določeno s pogoji elektroforeze in kakovostjo nosilnega medija. Tako se na primer med elektroforezo na papirju in filmih celuloznega acetata izolira 5 frakcij (albumini, α 1 -, α 2 -, β- in γ-globulini), medtem ko v poliakrilamidnem gelu - do 20 ali več frakcij. . Pri uporabi naprednejših metod (radialna imunodifuzija, imunoelektroforeza in drugi) se v sestavi globulinskih frakcij odkrijejo številni posamezni proteini.

Razvrščanje beljakovin v frakcije temelji na ločevanju beljakovin na papirju. Na proteinogram vplivajo le tiste beljakovine, katerih koncentracija je dovolj visoka.

V kliničnih diagnostičnih laboratorijih sta najpogostejši metodi elektroforeza na papirju in na filmih celuloznega acetata. Kot poenoteno odobrena je bila metoda elektroforeze na filmih celuloznega acetata.

Določanje beljakovinskih frakcij krvnega seruma z ekspresno metodo

Načelo

Fosfatni pufri različnih molskih jakosti obarjajo ustrezne beljakovinske frakcije, medtem ko bolj koncentrirani pufri obarjajo drobnejše beljakovinske frakcije. Stopnja motnosti se uporablja za presojo koncentracije beljakovinskih frakcij.

Metoda za elektroforetično ločevanje proteinov na papirju in filmih celuloznega acetata

Načelo

Delci koloidnih beljakovin se premikajo v enosmernem električnem polju: v alkalnem okolju do anode, v kislem okolju - do katode. V alkalnem okolju se najhitreje premikajo albumini, α 1 -, α 2 - in β-globulini.

Podrobnejši opis metode elektroforeze si lahko preberete.

Normalne vrednosti

Serum
predalbumin	0,6-1,4%	0,18-0,38 g/l
beljak	50-70%	30-50 g/l
α 1 -globulini	3-6%	1-3 g/l
α 2 -globulini	9-15%	6-10 g/l
β-globulini	8-18%	7-11 g/l
γ-globulini	15-25%	8-16 g/l
Razmerje albumin / globulin 1,5-2,3
cerebrospinalna tekočina
predalbumin	2-7%
beljak	56-76%
α 1 -globulini	2-7%
α 2 -globulini	4-12%
β-globulini	8-18%
γ-globulini	3-12%
urin
beljak	20%
α 1 -globulini	12%
α 2 -globulini	17%
β-globulini	43%
γ-globulini	8%

Klinična in diagnostična vrednost

Upošteva se diagnostična vrednost merjenja prealbumina in albumina

Serum

Globulini

V praksi je diagnostično pomembno samo povečanje ravni beljakovinskih frakcij.

Povečanje frakcije α 1 - in α 2 -globulina je povezano z akutnimi in subakutnimi vnetnimi procesi ter nekaterimi malignimi tumorji, poškodbami, ker. sem spada večina proteinov akutne faze (C-reaktivni protein, α 2 -makroglobulin, α 1 -glikoprotein, α 1 -antitripsin, ceruloplazmin, haptoglobin).

Večina beljakovin v frakciji β-globulina je torej β-lipoproteinov napredovanje Ta frakcija je najpogosteje povezana s hiperlipoproteinemijami. Poleg tega na dinamiko te frakcije vplivajo transferin, hemopeksin in komponente sistema komplementa.

Frakcija γ-globulinov poveča v patoloških stanjih, povezanih s kroničnimi vnetnimi procesi, tk. vsebuje imunoglobuline G, A in M.

Povzetek na temo:

Ločevanje beljakovin po velikosti z uporabo DDC-Na

Ločevanje beljakovin po velikosti z uporabo DDC-Na

Elektroforeza proteinov v preprostem sistemu je primerna za njihovo ločevanje, ne pa tudi za karakterizacijo. Elektroforetska mobilnost vsakega proteina v preprostem sistemu je hkrati odvisna od mase proteina in njegovega celotnega električnega naboja ter konfiguracije in togosti pakiranja proteinske globule. Prispevek vsakega od teh dejavnikov ni znan in se lahko znatno razlikuje glede na pogoje elektroforeze. Za vzpostavitev stroge korelacije med katerim koli od naštetih parametrov in elektroforetično mobilnostjo proteina je treba izključiti vpliv vseh ostalih.

Elektroforeza v PAAG z uporabo DDC-Na omogoča ločevanje proteinov, ki se razlikujejo le po molekulski masi. Da bi to naredili, mešanico beljakovin v originalnem pripravku obdelamo z vsaj trikratnim presežkom DDC-Na (po teži). Zaradi hidrofobnih interakcij se detergent enakovredno veže na veliko večino beljakovin v razmerju 1,4 mg DDC-Na na 1 mg beljakovin.

Zaradi velikega presežka popolnoma disociiranih ostankov sulfonske kisline, ki jih vnese detergent, je vloga lastnega naboja beljakovine v večini primerov nepomembna. Zaradi elektrostatičnega odbijanja tesno nameščenih negativno nabitih ostankov žveplove kisline se beljakovinska veriga zravna in dobi obliko toge palice s premerom -1,6 m in dolžino, ki je odvisna le od števila členov v tej verigi, zato na molekulsko maso beljakovine.

Hkrati s procesiranjem DDC-Na je treba zagotoviti možnost popolnega odvijanja proteinske verige, za to pa je potrebno pretrgati vse kovalentne S-S vezi znotraj proteinske molekule. V ta namen protein pred elektroforezo tudi obdelamo z visoko koncentracijo (1%) (3-merkaptoetanol pri povišani temperaturi).

Izkazalo se je, da je elektrofretska mobilnost, tj. hitrost migracije pri poljski jakosti 1 V/cm, togega proteinskega kompleksa DDC-Na povezana z molekulsko maso proteina (M) s preprostim razmerjem A-BIgM, kjer sta A in B koeficienta, ki sta odvisna od poroznosti gela, temperature in drugih eksperimentalnih pogojev. Primerneje je predstaviti vrednost in "v relativnih enotah, ki izražajo razmerje migracijskih poti proteina in "vodilnega barvila" - bromofenol modrega. To razmerje označimo kot Rf. Takšna zamenjava bo vplivala samo na vrednost koeficienta A in B, za katera vemo le, da sta v podatkovnih pogojih eksperimenta, sta enaka za vse proteine. Spremenjene vrednosti koeficientov bodo tudi v tem poskusu stalne vrednosti. Zato namesto pri njihovem določanju uporabijo metodo primerjave z »markerji«, ki jih poznamo po masi.Hkrati z elektroforezo proučevane mešanice proteinov ločeno sledi na isti plošči, to je pod enakimi eksperimentalnimi pogoji, ločimo mešanico znanih markerjev. .Z njihovo pomočjo se po točkah izriše odvisnost lgM=f(Rf), ki se seveda izkaže za premočrtno. Na podlagi te odvisnosti je mogoče grafično določiti vrednosti lg M iz izmerjenih vrednosti Rf in s tem tudi M za proučevani protein A. Seveda vsa predobdelava z detergentom in P-merk aptoetanola je treba izvesti popolnoma enako za ta protein in vse markerje.

Izbira pufra v tej varianti ne igra vloge, saj naboj proteina določa njegov kompleks z DDC-Na. Običajno se uporablja nevtralni pufer, ki mu dodamo 0,1 % DDC-Na, da ohranimo kompleks detergenta z beljakovinami.

Pri beljakovinah z molekulsko maso manj kot 12 tisoč daltonov določitev M postane nezanesljiva. Za različne masne razpone beljakovin je priporočljivo uporabiti PAAG z različnimi poroznostmi v skladu z naslednjo tabelo:

Območje M (kd) % PAAG 12-43 15 16-68 10 36-94 7,5 57-212 5

Postopek elektroforeze in barvanje proteinov po njegovem zaključku poteka kot običajno, vendar je bolje, da DDC-Na pred barvanjem speremo z proteina tako, da gel čez noč namočimo v 50 % TCA.

DDC-Na v kompleksu z beljakovino do neke mere preprečuje obarvanje (velik negativni naboj!).

Dvodimenzionalna elektroforeza v PAAG

Popolna ločitev kompleksne mešanice beljakovin ni vedno mogoča v enem samem elektroforetskem poskusu. Vedno obstaja možnost, da v danem sistemu elektroforeze različni proteini migrirajo v istem območju, bodisi zaradi bližine njihovih velikosti bodisi zaradi sovpadanja njihovih elektroforetskih mobilnosti pri izbrani vrednosti pH ali končno kot posledica kombinacije teh parametrov, ki je neugodna za ločevanje. Zato je v kompleksnih primerih frakcioniranja proteinske zmesi smiselno uporabiti separacijo v prvi smeri kot izhodišče za separacijo v drugi, pravokotni na prvo smer pri spremenjenih pogojih elektroforeze.

Da bi to naredili, je proga prve smeri (brez padavin in obarvanja beljakovin v njej) izrezana in nanesena na začetno cono plošče druge smeri (brez žepov). Stik med obema geloma se zagotovi tako, da mesto njunega stika prelijemo s staljeno raztopino agaroze v istem pufru. Elektroforeza se seveda izvaja v smeri, ki je pravokotna na trak. Vsak nehomogen pas v njem lahko povzroči več madežev v drugi smeri, če v novih pogojih proteini, ki jih vsebuje, pridobijo drugačno elektroforetično mobilnost. Posledično se po nanosu in obarvanju na plošči pojavi vzorec madežev, razporejenih po celotni površini (»prstni odtis«). Število madežev različnih beljakovin, ki jih je mogoče pritrditi na eno ploščo, lahko doseže več sto. Na sl. 42 prikazuje vzorec porazdelitve madežev, pridobljenih z dvodimenzionalno elektroforezo proteinov iz velike podenote ene od bakterij (v Mets, Bogorad Anal. Biochem. 57 200, 1974).

Ekstrakcija proteinov iz gela po elektroforezi

Za namene analitične identifikacije lahko proteine ​​iz PAAG (brez precipitacije in obarvanja) prenesemo na nitrocelulozni membranski filter. Takšni filtri imajo sposobnost adsorpcije glavnih beljakovin. Prenos se izvede tako, da se proteinski trakovi izperejo iz gela s puferskim tokom v smeri, ki je pravokotna na površino plošče. Filter se nanese neposredno na mokri gel. Naprava za zagotavljanje puferskega toka od gela do filtra bo opisana spodaj v povezavi z DNA elektroforezo.

Posledično se na filtru dobijo "replike" proteinov, ločenih v gelu. Za njihovo identifikacijo lahko uporabimo značilne reakcije, včasih encimske ali imunske (glej spodaj), pa tudi hibridizacijo z radiofosforjem označeno DNA ali RNA, če se ti proteini vežejo na DNA in vivo ali ločimo ribosomske proteine, ki se vežejo na ribosomsko RNA.

Glavna stvar, ki razlikuje nukleinske kisline od beljakovin z vidika elektroforeze, je pomemben skupni negativni naboj zaradi disociacije številnih ostankov fosforne kisline v vezeh med nukleozidi. pH okolja na ta naboj malo vpliva. Zato lahko elektroforezo izvajamo ne v pufru, temveč v kateri koli primerni raztopini, ki vsebuje ione, na primer v šibki raztopini alkalije. V vseh primerih se tekočemu mediju doda EDTA do koncentracije 1–2 mM. To je potrebno za blokiranje delovanja nukleaz in preprečevanje obarjanja (zlasti RNA) z dvovalentnimi kovinami.

Tako je treba ločevanje fragmentov DNA in RNA z elektroforezo izvesti le po velikosti. Vendar se lahko te velikosti razlikujejo v zelo širokem razponu: od deset nukleotidnih enot do več sto tisoč, in če so izražene z molekulsko maso, potem od nekaj tisoč do sto milijonov daltonov.

Za frakcioniranje razmeroma kratkih fragmentov se seveda uporablja elektroforeza v PAAG, za ločevanje DNK z visoko molekulsko maso pa je nosilec večjih por agaroza. Spoznali jo bomo malo kasneje. Vmes je v zvezi s prejšnjimi odstavki primerno podati nekaj pripomb o elektroforezi DNA v PAAG. Naslednja tabela podaja priporočila za izbiro poroznosti gela glede na velikost relativno kratkih fragmentov DNK, ki jih označuje število baznih parov (bp):

Razpon p.o. (stvari)

V zadnjem obsegu te tabele so mejne velikosti DNK, ki so na voljo za samodejno določanje zaporedja nukleotidov. O tej revolucionarni metodi analize DNK bomo razpravljali v naslednjem poglavju.

Zdaj, preden preidem na elektroforezo v agarozi, želim študente in bralce seznaniti z novimi idejami za frakcioniranje velikih fragmentov DNK v PAAG z izvirno uporabo impulzov električne napetosti, uporabljenih na gelu. Ti impulzi se izvajajo izmenično v dveh medsebojno pravokotnih smereh. Ideja tukaj je naslednja. Tudi zelo dolga in prožna molekula DNK se lahko stisne skozi razmeroma majhne pore gela, če jo raztegnemo v smeri napredovanja proti "glavni" anodi, recimo na dnu plošče. Napetost na tej anodi se ne dovaja konstantno, ampak v impulzih. Druga, "pomožna" anoda ustvarja električno poljsko jakost pravokotno na glavno smer gibanja DNK na dno plošče. Napetost se nanj nanaša tudi s precej močnimi, a krajšimi impulzi kot na glavno anodo, ki se izmenjujejo z njimi.

Namen "pravokotnega" električnega polja je vrteti dolge molekule velike DNK, tako da so v trenutku uporabe "vzdolžnega" impulza v položaju, ki je ugoden za gibanje vzdolž plošče navzdol do glavne anode. Daljše kot so verige DNK, počasneje bodo spreminjale svojo orientacijo in se zato počasneje premikale v pravo smer. Avtorji metode trdijo, da jim je na ta način uspelo ločiti fragmente DNK do pet milijonov baznih parov.

Agarozni geli

Agaroza je zelo čista frakcija naravnega linearnega polisaharida, agarja, izoliranega iz morskih alg. Z njim smo se že srečali.

Molekulska masa posameznih niti agaroze je v območju 10-100 tisoč daltonov. Agaroza za elektroforezo je na voljo kot liofiliziran (vakuumsko posušen) prašek. Do geliranja pride, ko se ohladi tudi zelo razredčena vroča raztopina agaroze v pufru. Pri temperaturi 84-96 ° C (in za nekatere vrste agaroze celo pri 70 ° C) se polimerne niti stopijo in z okoliškim vodnim medijem tvorijo homogeno prozorno tekočino. Ima izrazito temperaturno histerezo - zmrzne pri temperaturi približno 40 ° C. Pri ohlajanju na to temperaturo že 0,4% raztopine agaroze tvorijo močne gele. Pri taljivih vrstah agaroze se temperatura strjevanja zniža na 30 °. Ta lastnost agaroze olajša vse manipulacije z njenimi raztopinami brez strahu pred njihovim strjevanjem. Poleg tega suspenzijo agaroze v vodi, stopljeno na vreli kopeli, ohladimo na 50-55 ° in šele pri tej temperaturi dodamo koncentrat pufra in vse ostale dodatke ter nato vlijemo v kalup za elektroforezo. To je priročno in ni povezano s pojavom toplotnih deformacij.

Ohlajajoče se naključno usmerjene niti strjene agaroze zaradi večkratnih vodikovih vezi med nitkami zberejo v snope. Ti snopi, ki se prosto sekajo, ustvarjajo zelo veliko porozno in hkrati togo prostorsko mrežo v tekočini, ki jih obdaja.

Velikost por agaroznega gela je naravno povezana s koncentracijo njegove začetne raztopine. Lahko damo nekaj priporočil za izbiro te koncentracije, ki izhajajo iz izkušenj z elektroforezo nukleinskih kislin:

Za nukleinske kisline virusov in velikih plazmidov 0,4-0,5%.

Za restriktorje DNA, ki vsebujejo 5-20 tisoč baznih parov 0,7-0,8%.

Za krajšo restrikcijo DNA in dvoverižno RNA reovirusa 1,5 %.

Za ribosomsko RNA - 1,75%.

Za omejitev mRNA in DNA do 1000 bp - 2 %.

Priprava plošče za agarozno elektroforezo je zelo preprosta. Steklo zahtevane velikosti z vseh strani polepimo ob robu z neprekinjenim lepilnim trakom tako, da njegov zgornji rob štrli nekaj milimetrov nad stekleno površino. Slednji je postavljen na strogo vodoravno mizo. Izračunano prostornino še vedno tekoče raztopine agaroze vlijemo neposredno na kozarec. Nato se ob enem robu stekla vgradi glavnik, podoben tistemu, ki se vstavi v kalup PAAG pred njegovo polimerizacijo. Le da glavnik tokrat potopimo v agarozo pravokotno na kozarec (njegovi zobje pa se ne smejo dotikati kozarca). Ko se agaroza strdi, glavnik odstranimo in tako oblikujemo »vdolbinice« za pripravke. Elektroforezo izvajamo v vodoravnem položaju (v stezah) z uporabo stenj, ki prihajajo iz rezervoarjev s pufri. Delovna vrednost poljske jakosti je 2-5 V/cm.

DNA, zlasti dvoverižna, kot tudi RNA, se dobro obarvajo z rumenim fluorescentnim barvilom - bromid teh diem. To barvilo nosi pozitiven naboj, ki mu omogoča interakcijo s fosfatnimi skupinami nukleinskih kislin. Poleg tega se lahko interkalira (vgradi) med baze dvoverižne DNK, kar povzroči močno povečanje njene fluorescence ob osvetlitvi z ultravijolično svetlobo. Barvanje lahko opravimo tudi po elektroforezi tako, da gel za 0,5-1 uro namakamo v vodni raztopini barvila (1 μg/ml) ali ga vbrizgamo direktno v gel. V slednjem primeru je mogoče spremljati gibanje trakov v gelu. V tem primeru je steklena plošča osvetljena z UV žarnico od spodaj. Barvna občutljivost je visoka. Trakove, ki vsebujejo 0,01 μg DNA, lahko opazujemo in fotografiramo.

Na koncu elektroforeze lahko DNK fiksiramo v gelu z obarjanjem iz raztopine z namakanjem gela v 70 % etanolu.

Pipete

Seveda sodobne mikropipete sploh niso podobne tistim, ki se uporabljajo v šolskem kemijskem laboratoriju. To je njihova naprava. Precej voluminozen plastični (zunanji) ročaj pipete je udoben za držanje s štirimi prsti, palec pa pušča prost pritisk na gumb, ki štrli iz zgornjega konca ročaja. Od zgoraj navzdol izhaja dolga, rahlo stožčasta kovinska palica, na koncu katere je tesno nameščena stožčasta votla konica iz posebne plastike.

V ročaju se skriva mehanizem, katerega glavni del sta tanek valj in bat, ki ju navzgor pritiskata vzmet, ki sta zelo natančno nameščena drug na drugega. S pritiskom na gumb se bat premakne navzdol. Po spuščanju konice v tekočino in sprostitvi predhodno pritisnjenega gumba se v konico potegne volumen 1, 2, 3 ali več mikrolitrov - v skladu s kalibracijo pipete. S ponovnim pritiskom na gumb popolnoma potisnete tekočino iz ročnika. Ročniki so dobavljeni sterilizirani in se uporabljajo enkrat.

Obstajajo pipete z možnostjo prednastavitve volumna tekočine, na primer od 2 do 20 mikrolitrov. Nastavitev se izvede z vrtenjem glave vijaka, ki nastavi dolžino giba bata. Izbrana glasnost označuje graduiran boben, povezan z vijakom.

Vpliv sekundarne strukture DNK

Pri elektroforetskem obnašanju enoverižnih (denaturirana DNA, RNA) in dvoverižnih molekul nukleinskih kislin je veliko odvisno od njihove velikosti. V primeru kratkih polinukleotidnih verig ima njihova nativna dvoverižna molekula bolj togo strukturo kot enoverižna molekula enake velikosti. Težje se je upogniti, prehaja skozi prostorsko mrežo gela. Zaradi tega bodo razmeroma kratki dvoverižni fragmenti DNA med elektroforezo v PAAG zaostajali za denaturirano DNA enake dolžine. To stanje se bo zgodilo celo za DNK bakteriofaga FX-174 z molekulsko maso 3,5 milijona daltonov. Pri večjih molekulah pa je situacija lahko obrnjena. Dolga dvoverižna veriga je že dovolj prožna: premika se skozi pore gela, kot bi se »zvijala kot kača«. Medtem se enoverižna veriga enake dolžine zvije v ohlapno "kaotično kroglo" takšne velikosti, da je njeno gibanje v gelu težje. V tem primeru denaturirana DNA med elektroforezo zaostaja za nativno DNA. Seveda je meja obrata opisanega učinka odvisna od velikosti por gela.

Virusna in mitohondrijska dvoverižna DNK, pa tudi bakterijski plazmidi imajo strukturo zaprtega dvoverižnega obroča. Izvorno stanje takega obroča je "superzvit" (ustreza minimalnim notranjim napetostim). Prstan kot celota je zložen v "snop", kar močno poveča njegovo kompaktnost (forma I). Če pa se pojavi en sam prelom v sladkorno-fosfatni verigi vsaj v eni od dveh zvitih niti obroča, se snop razpre in pod delovanjem elektrostatičnih odbojnih sil fosfatnih skupin se obroč zravna. Kompaktnost molekule se zmanjša, njene zunanje mere se povečajo (oblika II). Kar zadeva linearno dvoverižno molekulo DNA (oblika III), se lahko glede na povprečno velikost gelskih por seli hitreje ali počasneje kot superzvit obroč enake mase. Za gel z velikimi porami je lahko odločilna kompaktnost oblike I; pri manjših porah pride do izraza večja prožnost linearne molekule DNA (oblika III).

Hitrost migracije linearnih dvoverižnih molekul DNA z naraščanjem mase upada, vendar le do določene meje. Pri molekulski masi več kot 5 milijonov v 1,6 % agaroznem gelu in pri masi več kot 12 milijonov daltonov v 0,8 % agarozi se molekule selijo s skoraj enako hitrostjo, ne glede na njihovo maso. V teh primerih igra prožnost odločilno vlogo - sposobnost zelo dolgih molekul, ki se zvijajo, da enako enostavno (ali enako težko) prehajajo skozi gel na poljubni dolžini.

Ribosomske RNA imajo lahko sekundarno strukturo, ki je bistveno bolj neugodna za migracijo v gelu kot DNA. Dejstvo je, da je v velikih molekulah RNK ​​ta struktura predstavljena s številnimi "lasnicami", ki štrlijo v vse smeri. To so mesta lokalnega združevanja v toge dvoverižne strukture ločenih, pogosto daleč narazen v glavnem zaporedju, komplementarnih odsekov RNA. Takšna molekula se ne more več premikati skozi pore gela.Pri sestavljanju glavnega »sendviča« (gela, filtra in listov filtrirnega papirja, ki se jim prilega) je treba paziti, da med njimi ne ostanejo zračni mehurčki.

Prenos DNK na nitrocelulozni filter traja 2-3 ure. Upoštevati je treba, da se kratki fragmenti DNA slabo zadržijo na nitroceluloznem filtru. Če je to nujno, potem je bolje uporabiti filtre iz tako imenovanega "diazo papirja" ali "DBM papirja". Whatman ga izda pod imenom "Whatman 540".

Literatura

1 Kurashvili L.V. Kršitve metabolizma lipidov v stresnih stanjih. II Zakharyjeva branja. Povzetki poročil. - 1995. -str.127.

2 Kurashvili L.V. Aktivnost lipaze in LCAT med dolgotrajno dehidracijo. V: Aktualna vprašanja v diagnostiki, zdravljenju in rehabilitaciji bolnikov. Povzetki poročil. - Penza, 1995. -str.71-72.

3 Kurashvili L.V. Status fosfolipidov v nasprotju s presnovo vode in elektrolitov. V: Aktualna vprašanja v diagnostiki, zdravljenju in rehabilitaciji bolnikov. Povzetki poročil. - Penza, 1995.-S.69-70.