§ 12. KINETIKA ENCIMATSKIH REAKCIJ
Kinetika encimskih reakcij je znanost o hitrostih encimskih reakcij, njihovi odvisnosti od različnih dejavnikov. Hitrost encimske reakcije je določena s kemično količino reagiranega substrata ali nastalega reakcijskega produkta na časovno enoto na prostorninsko enoto pod določenimi pogoji:
kjer je v hitrost encimske reakcije, sprememba koncentracije substrata ali reakcijskega produkta in t čas.
Hitrost encimske reakcije je odvisna od narave encima, ki določa njegovo aktivnost. Večja kot je aktivnost encima, večja je hitrost reakcije. Aktivnost encima je določena s hitrostjo reakcije, ki jo katalizira encim. Merilo encimske aktivnosti je ena standardna enota encimske aktivnosti. Ena standardna enota encimske aktivnosti je količina encima, ki katalizira pretvorbo 1 µmol substrata v 1 minuti.
Med encimsko reakcijo encim (E) interagira s substratom (S), kar ima za posledico tvorbo kompleksa encim-substrat, ki se nato razgradi s sproščanjem encima in produkta (P) reakcije:
Hitrost encimske reakcije je odvisna od številnih dejavnikov: koncentracije substrata in encima, temperature, pH medija, prisotnosti različnih regulatornih snovi, ki lahko povečajo ali zmanjšajo aktivnost encimov.
Zanimivo vedeti! Encimi se v medicini uporabljajo za diagnosticiranje različnih bolezni. Pri miokardnem infarktu zaradi poškodbe in razpada srčne mišice se vsebnost encimov aspartat transaminaze in alanin aminotransferaze v krvi močno poveča. Identifikacija njihove dejavnosti omogoča diagnosticiranje te bolezni.
Vpliv koncentracije substrata in encimov na hitrost encimske reakcije
Upoštevajte vpliv koncentracije substrata na hitrost encimske reakcije (slika 30.). Pri nizkih koncentracijah substrata je hitrost premosorazmerna z njegovo koncentracijo; nato z naraščajočo koncentracijo hitrost reakcije narašča počasneje, pri zelo visokih koncentracijah substrata pa je hitrost praktično neodvisna od njegove koncentracije in doseže največjo vrednost (Vmax) . Pri takšnih koncentracijah substrata so vse encimske molekule del encimsko-substratnega kompleksa in dosežena je popolna nasičenost aktivnih centrov encima, zato je hitrost reakcije v tem primeru praktično neodvisna od koncentracije substrata.
riž. 30. Odvisnost hitrosti encimske reakcije od koncentracije substrata
Graf odvisnosti aktivnosti encima od koncentracije substrata je opisan z enačbo Michaelis-Menten, ki je dobila ime po izjemnih znanstvenikih L.Michaelis in M.Menten, ki sta veliko prispevala k študiji. kinetike encimskih reakcij,
kjer je v hitrost encimske reakcije; [S] koncentracija substrata; K M je Michaelisova konstanta.
Razmislimo o fizičnem pomenu Michaelisove konstante. Če je v = ½ V max, dobimo K M = [S]. Tako je Michaelisova konstanta enaka koncentraciji substrata, pri kateri je hitrost reakcije polovica največje.
Hitrost encimske reakcije je odvisna tudi od koncentracije encima (slika 31). To razmerje je linearno.
riž. 31. Odvisnost hitrosti encimske reakcije od koncentracije encima
Vpliv temperature na hitrost encimske reakcije
Odvisnost hitrosti encimske reakcije od temperature je prikazana na sl. 32.
riž. 32. Odvisnost hitrosti encimske reakcije od temperature.
Pri nizkih temperaturah (do približno 40 - 50 ° C) povišanje temperature za vsakih 10 ° C v skladu z van't Hoffovim pravilom spremlja povečanje hitrosti kemijska reakcija 2-4 krat. Pri visokih temperaturah nad 55 - 60 ° C se aktivnost encima močno zmanjša zaradi njegove toplotne denaturacije in posledično opazimo močno zmanjšanje hitrosti encimske reakcije. Največjo aktivnost encimov običajno opazimo v območju 40 - 60 o C. Temperaturo, pri kateri je aktivnost encima največja, imenujemo temperaturni optimum. Temperaturni optimum encimov termofilnih mikroorganizmov je v območju višjih temperatur.
Vpliv pH na hitrost encimske reakcije
Graf odvisnosti encimske aktivnosti od pH je prikazan na sl. 33.
riž. 33. Vpliv pH na hitrost encimske reakcije
Graf odvisnosti od pH ima zvonasto obliko. Vrednost pH, pri kateri je aktivnost encima največja, se imenuje pH optimalni encim. Optimalne vrednosti pH za različne encime se zelo razlikujejo.
Narava odvisnosti encimske reakcije od pH je določena z dejstvom, da ta indikator vpliva na:
a) ionizacija aminokislinskih ostankov, ki sodelujejo pri katalizi,
b) ionizacija substrata,
c) konformacijo encima in njegovo aktivno mesto.
Zaviranje encimov
Hitrost encimske reakcije se lahko zmanjša z delovanjem številnih kemične snovi klical zaviralci. Nekateri zaviralci so strupeni za ljudi, na primer cianidi, medtem ko se drugi uporabljajo kot zdravila.
Inhibitorje lahko razdelimo na dve glavni vrsti: nepovraten in reverzibilen. Ireverzibilni inhibitorji (I) se vežejo na encim in tvorijo kompleks, katerega disociacija je nemogoča z obnovitvijo encimske aktivnosti:
Primer ireverzibilnega zaviralca je diizopropilfluorofosfat (DFF). DPP zavira encim acetilholinesterazo, ki ima pomembno vlogo pri prenosu živčnih impulzov. Ta zaviralec sodeluje s serinom aktivnega mesta encima in s tem blokira aktivnost slednjega. Posledično je motena sposobnost procesov živčnih celic nevronov za vodenje živčnega impulza. DFF je eno prvih živčnih strupov. Na njegovi osnovi so bili ustvarjeni številni relativno nestrupeni za ljudi in živali. insekticidi - snovi, strupene za žuželke.
Reverzibilne zaviralce je za razliko od ireverzibilnih pod določenimi pogoji enostavno ločiti od encima. Dejavnost slednjega se obnovi:
Reverzibilni inhibitorji vključujejo konkurenčen in nekonkurenčno zaviralci.
Kompetitivni inhibitor, ki je strukturni analog substrata, sodeluje z aktivnim mestom encima in tako blokira dostop substrata do encima. V tem primeru se inhibitor ne kemijsko transformira in se reverzibilno veže na encim. Po disociaciji kompleksa EI se lahko encim veže bodisi na substrat in ga transformira bodisi na inhibitor (slika 34.). Ker tako substrat kot inhibitor tekmujeta za mesto v aktivnem mestu, se ta inhibicija imenuje kompetitivna.
riž. 34. Mehanizem delovanja kompetitivnega inhibitorja.
V medicini se uporabljajo kompetitivni inhibitorji. Boriti se nalezljive bolezni prej pogosto uporabljana sulfanilamidna zdravila. Strukturno so blizu para-aminobenzojska kislina(PABA), esencialni rastni faktor za mnoge patogene bakterije. PABA je prekurzor folne kisline, ki služi kot kofaktor za številne encime. Sulfanilamidni pripravki delujejo kot kompetitivni zaviralec encimov za sintezo folne kisline iz PABA in s tem zavirajo rast in razmnoževanje patogenih bakterij.
Nekonkurenčni inhibitorji niso strukturno podobni substratu in med tvorbo EI ne delujejo z aktivnim mestom, temveč z drugim mestom encima. Medsebojno delovanje zaviralca z encimom povzroči spremembo strukture slednjega. Tvorba kompleksa EI je reverzibilna, zato lahko encim po njegovi razgradnji ponovno napade substrat (slika 35).
riž. 35. Mehanizem delovanja nekompetitivnega inhibitorja
CN - cianid lahko deluje kot nekompetitivni inhibitor. Veže se na kovinske ione, ki so del prostetičnih skupin, in zavira delovanje teh encimov. Zastrupitev s cianidom je izjemno nevarna. Lahko so usodne.
Alosterični encimi
Izraz "alosterični" izhaja iz grških besed allo - drugo, stereo - območje. Tako imajo alosterični encimi poleg aktivnega mesta še en center, imenovan alosterično središče(slika 36). Snovi, ki lahko spremenijo aktivnost encimov, se vežejo na alosterični center, te snovi imenujemo alosterični efektorji. Efektorji so pozitivni - aktivirajo encim, in negativni - inhibitorni, tj. zmanjšanje aktivnosti encimov. Na nekatere alosterične encime lahko vplivata dva ali več efektorjev.
riž. 36. Zgradba alosteričnega encima.
Regulacija večencimskih sistemov
Nekateri encimi delujejo usklajeno in se združujejo v večencimske sisteme, v katerih vsak encim katalizira določeno stopnjo presnovne poti:
V večencimskem sistemu obstaja encim, ki določa hitrost celotnega reakcijskega zaporedja. Ta encim je praviloma alosteričen in se nahaja na začetku presnovne poti. Z različnimi signali lahko poveča in zmanjša hitrost katalizirane reakcije in s tem uravnava hitrost celotnega procesa.
Hitrost encimskih reakcij je odvisna od koncentracije sub-
stratum. Ta odvisnost je kompleksna, ki jo pri nekaterih encimih opisuje parabolična krivulja (slika 29).
Slika 29 - Odvisnost hitrosti encimske reakcije
od koncentracije substrata
Parabolična narava odvisnosti je razložena z dejstvom, da interakcija encima s substratom povzroči nastanek kompleksa encim-substrat. Sprva se s povečanjem koncentracije substrata poveča koncentracija encimsko-substratnih kompleksov v reakcijski mešanici, kar se kaže v vzporednem povečanju hitrosti reakcije. Pri določeni koncentraciji substrata (nasičenje) pride do nekakšne "nasičenosti" vseh aktivnih centrov encimskih molekul v reakcijski mešanici. Hitrost encimske reakcije pri nasičeni koncentraciji postane največja. Z nadaljnjim povečanjem vsebnosti substrata v reakcijski mešanici se ne spremeni.
Iz grafa hitrosti encimske reakcije v odvisnosti od koncentracije substrata se izračunata dva pomembna indikatorja:
1. Največja hitrost reakcije (V največ). Definirana je kot hitrost reakcije pri nasičeni koncentraciji substrata. Vrednost največje hitrosti odraža katalitično moč encima. Encimi, ki so večji V max so močnejši katalizatorji. V časovni enoti katalizirajo transformacijo večjega števila substratnih molekul. Vrednost največje hitrosti je izražena s številom vrtljajev encima. Število vrtljajev je ocenjeno s številom substratnih molekul, ki jih encim pretvori v časovni enoti (s -1). Za večino encimov je prometno število v območju 10 4 . Hkrati obstajajo encimi, za katere hitrost znatno več (600.000 za karbanhidrazo) ali manj od te vrednosti (100 za kimotripsin).
2. Michaelisova konstanta (TO m). Michaelisova konstanta je koncentracija substrata, pri kateri je hitrost reakcije polovica največje. Vrednost TO m odraža afiniteto encima za substrat. Večja kot je ta vrednost, manjša je afiniteta do substrata za encim. TO m je izražen v molih substrata. Da, vrednost TO m glede na glukozo za encim glukokinazo je 10 mmol, za heksokinazo pa 0,01 mmol. Heksokinaza ima večjo afiniteto za glukozo kot glukokinaza; pri enaki koncentraciji substrata katalizira fosforilacijo glukoze hitreje.
Na podlagi matematične analize odvisnosti hitrosti encimske reakcije od koncentracije substrata sta L. Michaelis in M. Menten (1913) izpeljala formulo, ki omogoča ovrednotenje razmerja med hitrostjo reakcije, največjo stopnja in Michaelisova konstanta. Trenutno je definirana kot Michaelis-Mentenova enačba.
V o= V max[ S]/K m + [ S],
Kje V o hitrost reakcije, S je koncentracija substrata.
Splošne lastnosti encimov
Kljub obstoju določenih razlik v strukturi, delovanju in znotrajcelični lokalizaciji so za encime značilne številne skupne lastnosti. Ti vključujejo odvisnost manifestacije njihove katalitične aktivnosti od temperature (toplotna labilnost) in pH medija ter specifičnost substrata.
Značilna lastnost encimov je termolabilnost. Ta pojav lahko ponazorimo z grafom odvisnosti hitrosti encimske reakcije od temperature reakcijske zmesi (slika 30).
Slika 30 - Odvisnost hitrosti encimske reakcije od temperature
reakcijski medij ( t opt je optimalna temperatura; V- hitrost reakcije)
Kot je razvidno iz predstavljenega grafa, pri temperaturi blizu 4 ° C encimske reakcije praktično ne pridejo. Zaradi tega lahko biološke predmete pred biokemičnimi študijami določen čas hranimo na hladnem. Mraz vam omogoča, da hrano rešite pred avtolizo (samoprebavo).
Zvišanje temperature spremlja povečanje hitrosti encimske reakcije. Razlog za to je povečanje kinetične energije substrata in encimskih molekul, kar prispeva k povečanju hitrosti interakcije med njimi. Podoben pojav opazimo do temperature, ki ustreza temperaturnemu optimumu encima. Optimalni temperaturni encim ustreza temperaturi, pri kateri je hitrost encimske reakcije največja. Za encime toplokrvnih živali je običajno 28 o C ali 37 o C.
Nadaljnje zvišanje temperature reakcijske zmesi povzroči postopno zmanjšanje hitrosti encimske reakcije. Ta pojav je posledica procesa toplotne denaturacije proteinske polipeptidne verige. Denaturacijo spremlja sprememba strukture aktivnega mesta encima, kar povzroči zmanjšanje afinitete encima za substrat. Pri temperaturah nad 55 ° C večina encimov popolnoma izgubi svoje katalitične lastnosti (inaktivira). V zvezi s tem se segrevanje na 55–56 ° C pogosto uporablja za postopek pasterizacije, kar poveča rok uporabnosti živil (mleko itd.).
pH medija ima velik vpliv na hitrost encimske reakcije. Kot je razvidno iz prikazanega na sl. 31 graf, je po obliki podoben grafu odvisnosti hitrosti encimske reakcije od temperature.
Slika 31 - Odvisnost hitrosti ( V) encimska reakcija
na pH medija (pH opt - pH optimum encima)
Močno zmanjšanje hitrosti encimske reakcije pri ekstremnih vrednostih pH je povezano s pojavom denaturacije polipeptidne verige beljakovinske molekule pod delovanjem kislin in alkalij. Encim kaže največjo katalitično moč pri pH, ki je opredeljen s terminom pH optimalni encim. Večina znanih encimov ima optimalni pH v območju od 5,0 do 7,5. Hkrati obstaja veliko primerov encimov, pri katerih je pH optimum premaknjen v območje kislih ali alkalnih pH vrednosti. Ti encimi vključujejo:
Razlog za odvisnost hitrosti encimskih reakcij od pH je posledica dejstva, da ima pH vrednost medija izrazit vpliv na stopnjo ionizacije funkcionalnih skupin substrata. Značilnosti ionizacije molekule jantarne kisline pri različni kislosti medija (pH):
Hkrati pH medija vpliva tudi na stopnjo ionizacije aminokislinskih radikalov, ki sestavljajo aktivno središče encima:
Če se tvorba encimsko-substratnega kompleksa stabilizira zaradi elektrostatičnih interakcij, postane jasna vloga pH pri zagotavljanju optimalnih pogojev za encimsko reakcijo (slika 24).
Hitrost reakcij, ki jih katalizirajo encimi, pri interakciji s substrati pa elektrostatične interakcije niso pomembne, je v manjši meri odvisna od pH medija. Na sl. 32 prikazuje odvisnost hitrosti hidrolize beljakovin s papainom. Pri interakciji tega encima s substratom so bistvenega pomena hidrofobne interakcije. Kot je razvidno iz predstavljenega grafa, papain sploh nima jasno definiranega pH optimuma.
Slika 32 – Vpliv pH na hitrost hidrolize beljakovin s papainom.
Encimi imajo določeno specifičnost glede podlage. Specifičnost se nanaša na lastnost encimov, da katalizirajo transformacijo enega ali skupine substratov, podobnih strukturi. Obstaja več vrst encimske specifičnosti.
· absolutna specifičnost. Nanaša se na sposobnost encima, da katalizira pretvorbo samo enega substrata. Encimi z absolutno specifičnostjo vključujejo arginazo, urikazo restriktazo itd.
· Relativna specifičnost. Nanaša se na sposobnost encima, da katalizira transformacijo skupine substratov, podobnih strukturi (t.i. proteolitični encimi hidrolizirajo različne proteine, lipazo estri glicerol in višje maščobne kisline, heksokinaza fosforilira različne monosaharide). V tem primeru je specifičnost določena z dejstvom, da encim vpliva le na določeno vrsto vezi (proteolitični encimi hidrolizirajo peptidno vez, lipaza hidrolizira estrsko vez itd.).
· stereospecifičnost . Ta izraz se nanaša na lastnost encima, da katalizira pretvorbo enega stereoizomera substrata. Encimi, ki sodelujejo pri pretvorbi monosaharidov, torej kažejo specifičnost glede na njihovo D-stereoizomere in encime, ki sodelujejo pri pretvorbi aminokislin - v njihove L-stereo izomeri.
Aktivnost encimov
Značilnost encimov kot katalizatorjev je, da lahko spremenijo svoje katalitične lastnosti pod vplivom različnih zunanjih dejavnikov. Merilo manifestacije moči katalitičnega delovanja encimov je njihovo dejavnost. Sposobnost encimov, da spremenijo svojo aktivnost v različnih pogojih, je velikega biološkega pomena. Ta lastnost omogoča živi celici, da prilagodi stanje presnovnih procesov trenutnim potrebam celic, ki se lahko bistveno spremenijo pod vplivom različnih zunanjih dejavnikov.
Določanje encimske aktivnosti igra pomembno vlogo pri njihovi karakterizaciji. Nekaj jih je splošna načela kvantitativno določanje encimske aktivnosti. Aktivnost encimov je mogoče določiti na naslednji način:
bodisi s hitrostjo kopičenja v reakcijski mešanici, kjer se nahaja encim reakcijskega produkta;
ali s hitrostjo izginotja substrata encimske reakcije iz reakcijske mešanice.
Oba pristopa sta enakovredna in ju je mogoče uporabiti v praksi. Pri določanju encimske aktivnosti pa je treba upoštevati naslednje pogoje: v reakcijski mešanici, v kateri določamo encimsko aktivnost,
temperatura mora ustrezati temperaturnemu optimumu danega encima;
pH medija mora ustrezati pH optimumu danega encima;
Koncentracija substrata ne sme biti manjša od nasičene;
kofaktorji morajo biti prisotni, če sploh, za ta encim;
Prisotni morajo biti aktivatorji encimov.
Tako se aktivnost encima določi v optimalnih pogojih zanj. Pod temi pogoji je aktivnost encima sorazmerna z njegovo vsebnostjo v testnem vzorcu in se zato lahko uporabi za posredno oceno njegove koncentracije.
Encimsko aktivnost kvantificiramo kot enote dejavnosti. Ena enota encimske aktivnosti (ED) je aktivnost encima, pri kateri pod njegovim vplivom nastane 1 µmol reakcijskega produkta (ali izgine 1 µmol substrata) na minuto.. V sistemu SI je katal (mačka) vzet kot enota encimske aktivnosti. 1 katal ustreza aktivnosti encima, pri kateri nastane en mol produkta reakcije (izgine en mol substrata) na sekundo.
Količina se uporablja tudi za karakterizacijo encimov. specifično dejavnost. Ta enota odraža aktivnost encima na enoto mase in je izražena v µmol/min mg beljakovine. Za oceno čistosti encimskih pripravkov se uporabljajo enote specifične aktivnosti. Višja kot je vrednost specifične aktivnosti, čistejši je encimski pripravek.
Odvisnost hitrosti reakcije od koncentracije encima in koncentracije substrata (kinetika encimskih reakcij) je prikazana v grafih.
urnik 1 urnik 2
V encimski reakciji ( F+S 2 ó 1 FS → 3 F + P) razlikujejo hitrost treh komponent stopenj:
1-tvorba encimsko-substratnega kompleksa FS,
2- povratni razpad kompleksa encim-substrat,
3 - razgradnja kompleksa encim-substrat s tvorbo reakcijskih produktov. Hitrost vsake od teh reakcij je podrejena zakonu množičnega delovanja:
V 1 \u003d K 1 [F] * [S]
V 2 \u003d K 2 *
V trenutku ravnotežja je hitrost reakcije nastajanja FS enaka vsoti hitrosti njegovega razpada: V 1 \u003d V 2 + V 3. Od treh stopenj encimske reakcije je tretja najpomembnejša in najpočasnejša, saj je povezana s tvorbo reakcijskih produktov. Z zgornjo formulo je nemogoče najti hitrost V 3, ker je kompleks encim-substrat zelo nestabilen, merjenje njegove koncentracije je težko. V zvezi s tem je Michaelis-Menten uvedel Km - Michaelisovo konstanto in transformiral enačbo za merjenje V 3 v novo enačbo, v kateri so resnično merljive količine:
V 3 \u003d K 3 * * [S] / Km + [S] ali V 3 \u003d V max * [S] / Km + [S]
je začetna koncentracija encima
Km je Michaelisova konstanta.
Fizični pomen km: Km \u003d (K 2 + K 3) / K 1. Prikazuje razmerje med konstantami hitrosti razgradnje kompleksa encim-substrat in konstanto hitrosti njegove tvorbe.
Michaelis-Mentenova enačba je univerzalna. Ponazarja odvisnost hitrosti reakcije od [S]
1. Odvisnost hitrosti reakcije od koncentracije substrata. Ta odvisnost se pokaže pri nizkih koncentracijah substrata [S]
2. Odvisnost hitrosti od koncentracije encima se kaže pri visokih koncentracijah substrata. S≥Km. V tem primeru lahko Km zanemarimo in enačba postane: V 3 \u003d K 3 * (( * [S]) / [S]) \u003d K 3 * \u003d V max. Tako je pri visoki koncentraciji substrata hitrost reakcije določena s koncentracijo encima in doseže največjo vrednost V 3 \u003d K 3 \u003d V max.(tretji del grafa 2).
3. Omogoča določitev številčne vrednosti km pod pogojem V 3 = V max /2. V tem primeru ima enačba obliko:
V max /2 = ((V max *[S])/Km+[S]), od koder sledi Km=[S]
Tako je Km številčno enaka koncentraciji substrata pri reakcijski hitrosti, ki je enaka polovici maksimuma. Km je zelo pomembna značilnost encima, meri se v molih (10 -2 - 10 -6 mol) in označuje specifičnost encima: nižji kot je Km, večja je specifičnost encima.
Grafična definicija Michaelisove konstante.
Bolj priročno je uporabiti graf, ki predstavlja ravno črto. Tak graf je predlagal Lineweaver - Burke (graf dvojnih recipročnih vrednosti), ki ustreza inverzni Michaelis - Mentenovi enačbi
Skoraj vse biokemične reakcije so encimske. Encimi(biokatalizatorji) so snovi beljakovinske narave, ki jih aktivirajo kovinski kationi. Poznamo približno 2000 različnih encimov, izoliranih pa jih je okoli 150, nekateri se uporabljajo kot zdravila. Tripsin in kimotripsin se uporabljata za zdravljenje bronhitisa in pljučnice; pepsin - za zdravljenje gastritisa; plazmin - za zdravljenje srčnega infarkta; pankreatin - za zdravljenje trebušne slinavke. Encimi se od običajnih katalizatorjev razlikujejo po (a) višji katalitični aktivnosti; (b) visoka specifičnost, tj. selektivno delovanje.
Mehanizem encimske reakcije z enim substratom lahko predstavimo s shemo:
kjer je E encim,
S - substrat,
ES - encimsko-substratni kompleks,
R je produkt reakcije.
Značilnost prve stopnje encimske reakcije je Michaelisova konstanta (K M). K M je recipročna konstanta ravnotežja:
Michaelisova konstanta (KM) označuje stabilnost kompleksa encim-substrat (ES). Manjša kot je Michaelisova konstanta (KM), stabilnejši je kompleks.
Hitrost encimske reakcije je enaka hitrosti stopnje, ki omejuje njeno hitrost:
kjer je k 2 konstanta hitrosti, imenovana število vrtljajev oz molekularna aktivnost encima.
molekularna aktivnost encima(k 2) je enako številu substratnih molekul, ki se transformirajo pod vplivom ene encimske molekule v 1 minuti pri 25 0 C. Ta konstanta ima vrednosti v območju: 1 10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .
Za ureazo, ki pospešuje hidrolizo sečnine, k 2 = 1,85∙10 6 min‾ 1; za adenozin trifosfatazo, ki pospešuje hidrolizo ATP, k 2 = 6,24∙10 6 min‾ 1; za katalazo, ki pospešuje razgradnjo H 2 O 2, k 2 = 5∙10 6 min‾ 1.
Vendar pa je kinetične enačbe encimske reakcije v obliki, v kateri je navedena zgoraj, praktično nemogoče uporabiti zaradi nezmožnosti eksperimentalnega določanja koncentracije kompleksa encim-substrat (). Izražanje v drugih količinah, ki jih je enostavno eksperimentalno določiti, dobimo kinetično enačbo encimskih reakcij, klical Michaelis-Mentenova enačba (1913):
,
kjer je produkt k 2 [E]tot vrednost konstante, ki je označena z (največja hitrost).
Oziroma: 
Razmislite o posebnih primerih Michaelis-Mentenove enačbe.
1) Pri nizki koncentraciji substrata torej K M >> [S].
ki ustreza kinetični enačbi reakcije prvega reda.
2) Pri visoki koncentraciji substrata K m<< [S], поэтому
ki ustreza kinetični enačbi reakcije ničelnega reda.
Tako se pri nizki koncentraciji substrata hitrost encimske reakcije povečuje s povečanjem vsebnosti substrata v sistemu, pri visoki koncentraciji substrata pa kinetična krivulja doseže plato (hitrost reakcije ni odvisna od koncentracije substrata) ( Slika 30).
Slika 30. - Kinetična krivulja encimske reakcije
Če je [S] = K M, potem
ki vam omogoča grafično določitev Michaelisove konstante K m (slika 31).
Slika 31. - Grafična definicija Michaelisove konstante
Na aktivnost encimov vplivajo: (a) temperatura, (b) kislost medija, (c) prisotnost inhibitorjev. Vpliv temperature na hitrost encimske reakcije je obravnavan v poglavju 9.3.
Vpliv kislosti medija na hitrost encimske reakcije prikazuje slika 32. Največja aktivnost encima ustreza optimalni vrednosti pH vrednosti (pH opt).
Slika 32. - Vpliv kislosti raztopin na aktivnost encimov
Za večino encimov optimalne vrednosti pH sovpadajo s fiziološkimi vrednostmi (7,3 - 7,4). Vendar pa obstajajo encimi, ki za svoje normalno delovanje potrebujejo močno kislo (pepsin - 1,5-2,5) ali precej alkalno okolje (arginaza - 9,5 - 9,9).
Zaviralci encimov- To so snovi, ki zasedajo del aktivnih središč encimskih molekul, zaradi česar se hitrost encimske reakcije zmanjša. Kationi težkih kovin, organske kisline in druge spojine delujejo kot inhibitorji.
Predavanje 11
Struktura atoma
Obstajata dve definiciji pojma "atom". Atom je najmanjši delec kemijskega elementa, ki ohrani njegove kemijske lastnosti.
Atom je električno nevtralen mikrosistem, ki ga sestavljata pozitivno nabito jedro in negativno nabita elektronska ovojnica.
Nauk o atomu je prehodil dolgo pot razvoja. Glavne stopnje v razvoju atomistike vključujejo:
1) naravno-filozofska stopnja - obdobje oblikovanja koncepta atomske strukture snovi, ki ni potrjeno z eksperimentom (5. stoletje pr. n. št. - 16. stoletje n. št.);
2) stopnja oblikovanja hipoteze o atomu kot najmanjšem delcu kemičnega elementa (XVIII-XIX stoletja);
3) stopnja ustvarjanja fizičnih modelov, ki odražajo kompleksnost strukture atoma in omogočajo opis njegovih lastnosti (začetek 20. stoletja)
4) sodobna stopnja atomistike se imenuje kvantna mehanika. Kvantna mehanika je veja fizike, ki proučuje gibanje osnovnih delcev.
NAČRTUJ
11.1. Struktura jedra. Izotopi.
11.2. Kvantno-mehanski model elektronske ovojnice atoma.
11.3. Fizikalne in kemijske lastnosti atomov.
Struktura jedra. izotopi
atomsko jedro- To je pozitivno nabit delec, sestavljen iz protonov, nevtronov in nekaterih drugih elementarnih delcev.
Splošno sprejeto je, da so glavni osnovni delci jedra protoni in nevtroni. Proton (p) - je elementarni delec, katerega relativna atomska masa je 1 amu in njegov relativni naboj + 1. Nevtron (n) - je osnovni delec, ki nima električnega naboja, katerega masa je enaka masi protona.
Jedro vsebuje 99,95 % mase atoma. Med osnovnimi delci delujejo posebne jedrske sile raztezanja, ki bistveno presegajo sile elektrostatičnega odboja.
Osnovna lastnost atoma je napolniti njegov jedra, enako številu protonov in sovpada z zaporedno številko elementa v periodnem sistemu kemijskih elementov. Zbirka (vrsta) atomov z enakim jedrskim nabojem se imenuje kemični element. Elemente s številkami od 1 do 92 najdemo v naravi.
izotopi- To so atomi istega kemičnega elementa, ki vsebujejo enako število protonov in različno število nevtronov v jedru.
kjer je masno število (A) masa jedra, z je naboj jedra.
Vsak kemični element je mešanica izotopov. Praviloma ime izotopov sovpada z imenom kemičnega elementa. Za vodikove izotope pa so uvedli posebna imena. Kemični element vodik predstavljajo trije izotopi:
Število p Število n
Protium H 10
Devterij D 1 1
Tritij T 1 2
Izotopi kemičnega elementa so lahko stabilni ali radioaktivni. Radioaktivni izotopi vsebujejo jedra, ki se spontano zrušijo s sproščanjem delcev in energije. Stabilnost jedra določa razmerje med nevtroni in protoni.
Radionuklidi, ki vstopijo v telo, motijo potek najpomembnejših biokemičnih procesov, zmanjšajo imunost in obsojajo telo na bolezni. Telo se pred učinki sevanja ščiti s selektivnim vsrkavanjem elementov iz okolja. Stabilni izotopi imajo prednost pred radioaktivnimi izotopi. Z drugimi besedami, stabilni izotopi blokirajo kopičenje radioaktivnih izotopov v živih organizmih (Tabela 8).
Knjiga S. Shannona "Nutrition in the Atomic Age" navaja naslednje podatke. Če se blokirni odmerek stabilnega izotopa joda, ki je enak ~100 mg, vzame najkasneje 2 uri po vstopu I-131 v telo, se absorpcija radioaktivnega joda v ščitnici zmanjša za 90%.
Radioizotopi se uporabljajo v medicini
za diagnozo nekaterih bolezni,
za zdravljenje vseh oblik raka,
za patofiziološke študije.
Tabela 8 - Blokirajoč učinek stabilnih izotopov
Kinetika encimskih reakcij. Kinetika proučuje hitrosti, mehanizme reakcij in vpliv dejavnikov, kot so koncentracija encimov in substratov, temperatura, pH medija, prisotnost inhibitorjev ali aktivatorjev.
Pri konstantni koncentraciji substrata je hitrost reakcije premo sorazmerna s koncentracijo encima. Graf odvisnosti hitrosti encimske reakcije od koncentracije substrata ima obliko enakokrake hiperbole.
Odvisnost hitrosti encimske reakcije od koncentracije encima (a) in substrata (b)
Opisana je odvisnost hitrosti encimske reakcije od koncentracije substrata Michaelis-Mentenova enačba:
kjer je V stacionarna hitrost biokemične reakcije; Vmax - največja hitrost; Km - Michaelisova konstanta; [S] - koncentracija substrata.
Če je koncentracija substrata nizka, tj. [S]<< Кm, то [S] в знаменателе можно пренебречь.
Potem 
Tako je pri nizkih koncentracijah substrata hitrost reakcije neposredno sorazmerna s koncentracijo substrata in je opisana z enačbo prvega reda. To ustreza začetnemu ravnemu odseku krivulje V = f[S] (slika b).
Pri visokih koncentracijah substrata [S] >> Km, ko lahko Km zanemarimo, ima Michaelis-Mentenova enačba obliko, tj. V=Vmaks.
Tako pri visokih koncentracijah substrata hitrost reakcije postane največja in je opisana z enačbo ničelnega reda. To ustreza odseku krivulje V =f [S], ki je vzporeden z osjo x.
Pri koncentracijah substrata, ki so numerično primerljive z Michaelisovo konstanto, hitrost reakcije postopoma narašča. To je povsem skladno s predstavami o mehanizmu encimske reakcije:
kjer je S substrat; E - encim; ES - encimsko-substratni kompleks; P - izdelek; k1 konstanta hitrosti tvorbe kompleksa encim-substrat; k2 je konstanta hitrosti razgradnje kompleksa encim-substrat s tvorbo začetnih reagentov; k3 je konstanta hitrosti razgradnje kompleksa encim-substrat s tvorbo produkta.
Stopnja pretvorbe substrata s tvorbo produkta (P) je sorazmeren s koncentracijo encimsko-substratnega kompleksa. Pri nizkih koncentracijah substrata vsebuje raztopina določeno število prostih encimskih molekul (E), ki niso vezane v kompleks (ES). Zato se z večanjem koncentracije substrata povečuje koncentracija kompleksov, posledično pa tudi hitrost nastajanja produkta. Pri visokih koncentracijah substrata se vse encimske molekule vežejo v kompleks ES (fenomen nasičenosti encima), zato nadaljnje povečanje koncentracije substrata praktično ne poveča koncentracije kompleksov, hitrost tvorbe produkta pa ostane konstantna.
Tako postane fizični pomen največje hitrosti encimske reakcije jasen. Vmax je hitrost, pri kateri reagira encim, ki v celoti obstaja kot kompleks encim-substrat..
Michaelisova konstanta numerično ustreza takšni koncentraciji substrata, pri kateri je stacionarna hitrost enaka polovici največje. Ta konstanta označuje disociacijsko konstanto kompleksa encim-substrat:
Fizični pomen Michaelisove konstante v tem, da označuje afiniteto encima za substrat. Km ima majhne vrednosti, ko je k1 > (k2 + k3), tj. proces nastajanja kompleksa ES prevladuje nad procesi disociacije ES. Zato nižja kot je vrednost Km, večja je afiniteta encima za substrat. Nasprotno, če je Km velik, potem (k2 + k3) > k1 in prevladujejo procesi disociacije ES. V tem primeru je afiniteta encima do substrata nizka.
Zaviralci in aktivatorji encimov . Zaviralci encimov imenujemo snovi, ki zmanjšajo aktivnost encimov. Kakršna koli sredstva za denaturacijo (na primer soli težkih kovin, kisline) so nespecifični zaviralci encimov.
Reverzibilni zaviralci so spojine, ki nekovalentno interagirajo z encimom. ireverzibilnih zaviralcev- to so spojine, ki specifično vežejo funkcionalne skupine aktivnega centra in tvorijo kovalentne vezi z encimom.
Reverzibilno inhibicijo delimo na kompetitivno in nekonkurenčno. Konkurenčna inhibicija kaže na strukturno podobnost med inhibitorjem in substratom. Inhibitor zasede mesto v aktivnem mestu encima in znatno število encimskih molekul je blokiranih. Konkurenčno inhibicijo lahko odstranimo s povečanjem koncentracije substrata. V tem primeru substrat izpodrine kompetitivni inhibitor iz aktivnega mesta.
Reverzibilna inhibicija je lahko nekonkurenčno glede podlage. V tem primeru inhibitor ne tekmuje za mesto pritrditve na encim. Substrat in inhibitor se vežeta na različni mesti, zato pride do tvorbe kompleksa IE, pa tudi ternarnega kompleksa IES, ki lahko razpade s sproščanjem produkta, vendar počasneje kot kompleks ES.
Avtor: naravo vašega dejanja zaviralce delimo na:
- specifično,
- nespecifična.
Specifični zaviralci vplivajo na encim, se povežejo s kovalentno vezjo v aktivnem središču encima in ga izključijo iz sfere delovanja.
Nespecifična inhibicija vključuje učinek denaturacijskih sredstev na encim (soli težkih kovin, sečnina itd.). V tem primeru se zaradi uničenja kvartarne in terciarne strukture proteina izgubi biološka aktivnost encima.
Aktivatorji encimov so snovi, ki povečajo hitrost encimske reakcije. Najpogosteje kot aktivatorji delujejo kovinski ioni (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Mg2+ itd.). Razlikovati med kovinami, ki so del metaloencimov, ki so kofaktorji in delujejo kot aktivatorji encimov. Kofaktorji se lahko močno vežejo na beljakovinski del encima, aktivatorji pa se zlahka ločijo od apoencima. Takšne kovine so obvezni udeleženci katalitičnega dejanja, ki določajo aktivnost encima. Aktivatorji povečati katalitični učinek, vendar njihova odsotnost ne prepreči poteka encimske reakcije. Praviloma kovinski kofaktor interagira z negativno nabitimi skupinami substrata. Pri izmenjavi elektronov med substratom in encimom sodeluje kovina s spremenljivo valenco. Poleg tega sodelujejo pri tvorbi stabilne prehodne konformacije encima, kar prispeva k hitrejšemu nastanku kompleksa ES.
Regulacija encimske aktivnosti . Eden glavnih mehanizmov za uravnavanje metabolizma je uravnavanje aktivnosti encimov. En primer je alosterična regulacija, regulacija z aktivatorji in inhibitorji. Pogosto se zgodi, da je končni produkt presnovne poti zaviralec regulatornega encima. Ta vrsta zaviranja se imenuje retroinhibicija ali inhibicija z negativno povratno informacijo.
Mnogi encimi nastanejo kot neaktivni prekurzorji proencimov in se nato aktivirajo ob pravem času z delno proteolizo. Delna proteoliza- cepitev dela molekule, kar povzroči spremembo terciarne strukture proteina in nastanek aktivnega centra encima.
Nekateri oligomerni encimi lahko spremenijo svojo aktivnost zaradi asociacije – disociacije podenot vključeni v njihovo sestavo.
Številne encime lahko najdemo v dveh oblikah: kot preprost protein in kot fosfoprotein. Prehod iz ene oblike v drugo spremlja sprememba katalitične aktivnosti.
Hitrost encimske reakcije je odvisna od količine encimov, ki je v celici določen z razmerjem hitrosti njegove sinteze in razpada. Ta način uravnavanja hitrosti encimske reakcije je počasnejši proces kot uravnavanje aktivnosti encimov.